太阳城集团

  • / 84
  • 下载费用:30 金币  

血管新生治疗方法.pdf

关 键 词:
血管 新生 治疗 方法
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利号:

CN200580035893.2

申请日:

20050819

公开号:

太阳城集团CN101123879A

公开日:

20080213

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01N37/18,A61K38/00 主分类号: A01N37/18,A61K38/00
申请人: 约翰·霍普金斯大学
发明人: S·查特吉
地址: 美国马里兰州
优先权: 60/603,016
专利代理机构: 北京纪凯知识产权代理有限公司 代理人: 程伟
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN200580035893.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明包括涉及乳糖基神经酰胺疾病、手术后症状与细菌感染的治疗与预防方法。该方法是普遍地提供将一种或多种化合物投与对象,已改变该VEGF途径成员的活性,该成员包括LcaCer合成酶(GalT-V/VI)、PECAM1、VEGFR、VEGF或相关的途径成员,去治疗患者患有或易感染由VEGF造成或贡献的症状。本发明也太阳城集团侦测与分析化合物治疗该症状的治疗能力的方法。

权利要求书

1.一种治疗患有或易感染涉及血管新生疾病或症状的对象的方法,包括向该对象投与治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂。2.根据权利要求1所述的方法,其中涉及血管新生疾病或症状是癌症、冠状动脉心脏病、肿瘤转移、发炎血管疾病或糖尿病。3.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF途径包括一个或多个乳糖基神经酰胺合成酶(LacCer合成酶)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、乳糖基神经酰胺(LacCer)或PLA2的介入或相互作用。4.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF途径抑制剂是如通式I的化合物:其中R和R是独立地选自氢或有取代或未取代的直链或支链C-C烷基所组成的群组,且进一步地其中R和R可能被连接形成5、6或7-元环;R是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C-C烷基所组成的群组;且R是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C-C烷基或芳基或取代的芳基所组成的群组;其中该取代基是卤素、C-C烷氧基、亚甲二氧基、C-C巯基、氨基或取代的氨基,该氨基取代基可能是C-C烷基或其医药上可接受的盐。5.根据权利要求4所述的方法,其中R和R被连接形成5、6或7-元环。6.根据权利要求5所述的方法,其中R和R1被连接形成吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、或氮杂环庚基环。7.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF途径抑制剂是一个或多个的1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇;1-苯基-2-十六酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇;1-苯基-2-十六酰氨基-3-哌啶基-1-丙醇;1-苯基-2-十六酰氨基-3-吡咯烷基-1-丙醇;1-吗啉基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯;1-吡咯烷基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯;(1R,2R)-1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇(D-PDMP);或反式-(2R,3R)-1-吡咯烷基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯、氯化白屈菜红碱(chelerythrinbe)。8.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF途径抑制剂是一个或多个的SU-1489、G6976、G6850、溴代苯甲酰甲基溴(BMB)、甲基-花生四酰基-氟磷酸酯(MAFP)、吡咯烷基二硫代羧酸、氯化二亚苯基碘及N-乙酰基-L-半胱氨酸;PECAM-1、PLA2、LacCer、或LacCer合成酶抗体或其片段;PECAM-1、PLA2、LacCer或LacCer合成酶肽或PECAM-1、PLA2、LacCer、或LacCer合成酶RNAi。9.根据权利要求8所述的方法,其中该RNAi是一个或多个的5’-CGG、AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3’(正义)、5、UGU UAA GCCACU CAC UCC G dTdT-3’(反义)或其片段或变化物。10.根据权利要求8所述的方法,其中该PECAM-1、PLA2、LacCer或LacCer合成酶抗体是特定的针对IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND(GalT-V);IGMHMI----RLYTNKNSTLNGT(GalT-VI);VLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADN(PECAM-1);PERLP;PTIKLGGHWKP;PRWKVAILIP;PFRNRHEHLP;PVLFRHLLP;PEGDTGKYKSIP;PENFTYSP;PYLP;PCPEKLP;PGGHWRP;PRWKVAVLIP;PFRNRHEHLP;PIFFLHLIP;PEGDLGKYKSIP;PELAP;CC(P)-x-H-(LGY)-x-C,其中组氨酸H是该酶(PLA2)或其片段或变化物的活性部位。11.根据权利要求8所述的方法,其中该PECAM-1、PLA2、LacCer或LacCer合成酶肽是一个或多个的IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND(GalT-V);IGMHMI----RLYTNKNSTLNGT(GalT-VI);VLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADN(PECAM-1);PERLP;PTIKLGGHWKP;PRWKVAILIP;PFRNRHEHLP;PVLFRHLLP;PEGDTGKYKSIP;PENFTYSP;PYLP;PCPEKLP;PGGHWRP;PRWKVAVLIP;PFRNRHEHLP;PIFFLHLIP;PEGDLGKYKSIP;PELAP;CC(P)-x-H-(LGY)-x-C,其中组氨酸H是该酶或其片段或变化物的活性部位。12.根据权利要求1所述的方法,进一步包括识别该对象所需太阳城集团血管新生疾病或症状的治疗。13.根据权利要求12所述的方法,其中该识别包括癌症、冠状动脉心脏病、肿瘤转移、发炎血管疾病、缺血-再灌注损伤、高血压或糖尿病的诊断。14.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF途径抑制剂是经口地、肌肉内、肿瘤内、支架或腹膜内投与该对象。15.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF抑制剂的有效治疗量缓和VEGF诱导的体外血管新生/管子形成。16.根据权利要求1所述的方法,其中该VEGF途径抑制剂是涂布于或包含在医学装置中的一个或多个。17.根据权利要求16所述的方法,其中该医学装置包括生物可降解的生物高分子。18.根据权利要求17所述的方法,其中该医学装置是支架。19.一种供确认VEGF途径抑制剂降低对象血管新生的治疗能力的方法,包括:将对象实施侵入性手术;将VEGF途径抑制剂投与对象;及测试该对象的血管生长。20.根据权利要求19所述的方法,其中该侵入性手术是肿瘤摘除手术。21.根据权利要求19所述的方法,其中该对象是动物模型。22.根据权利要求21所述的方法,其中该动物模型是肿瘤异种移植物。23.一种供确认VEGF途径抑制剂降低对象血管新生的治疗能力的方法,包括:确认对象血管新生的预治疗水平;将VEGF途径抑制剂的治疗有效量投与该对象;及确认该对象血管新生的后治疗水平。24.根据权利要求23所述的方法,其中血管新生的减少表明该VEGF途径抑制剂是有效的。25.根据权利要求23所述的方法,其中血管新生的该预治疗水平与后治疗水平是在疾病组织中确认。26.根据权利要求23所述的方法,其中该疾病组织是肺脏、心脏、肝脏、肿瘤或脉管系统的一个或多个。27.根据权利要求23所述的方法,其中该血管新生水平是通过PECAM-1表达、GatT-V表达、管子形成或LacCer水平确认。28.一种供确认候选VEGF途径抑制剂治疗血管新生的治疗能力的方法,包括:提供细胞群;将该细胞接触候选组合物,及确认该候选组合物在PECAM-1表达、GatT-V表达、管子形成或LacCer水平的一个或多个的效果。29.根据权利要求28所述的方法,进一步包括在该细胞接触该候选化合物前,将该细胞接触VEGF。30.根据权利要求28所述的方法,进一步包括在该细胞接触该候选化合物后,将该细胞接触VEGF。31.一种治疗患有或易感染组织退化的对象的方法,包括将血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂的治疗有效量的投与该对象。32.根据权利要求31所述的方法,其中该组织退化是太阳城集团胎儿子宫内成长、系统性硬化症、创伤愈合、缺血、再灌注损伤、糖尿病、冠状动脉病、肿瘤生长。33.根据权利要求31所述的方法,其中该VEGF途径包括一个或多个乳糖基神经酰胺合成酶(LacCer合成酶)、VEGF、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、乳糖基神经酰胺(LacCer)或PLA2的介入或相互作用。34.根据权利要求31所述的方法,其中该VEGF途径活化剂是如通式I化合物的L异构物:其中R和R是独立地选自氢或有取代或未取代的直链或支链C-C烷基所组成的群组,且进一步地其中R和R可能被连接形成5、6或7-元环;R是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C-C烷基所组成的群组;且R是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C-C烷基或芳基或取代的芳基所组成的群组;其中该取代基是卤素、C-C烷氧基、亚甲二氧基、C-C巯基、氨基或取代的氨基,该氨基取代基可能是C-C烷基或其医药上可接受的盐。35.根据权利要求34所述的方法,其中R和R被连接形成5、6或7-元环。36.根据权利要求35所述的方法,其中R和R被连接形成吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、或氮杂环庚基环。37.根据权利要求31所述的方法,其中该VEGF途径抑制剂是1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇;1-苯基-2-十六酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇;1-苯基-2-十六酰氨基-3-哌啶基-1-丙醇;1-苯基-2-十六酰氨基-3-吡咯烷基-1-丙醇;1-吗啉基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯;1-吡咯烷基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯的一个或多个L异构物。38.根据权利要求31所述的方法,进一步包括确认该对象需要进行组织退化治疗。39.根据权利要求38所述的方法,其中该VEGF途径活化剂是经口地、肌肉内、肿瘤内、支架或腹膜内投与该对象。40.一种供确认VEGF途径活化剂降低对象组织退化的治疗能力的方法,包括:确认对象组织退化的预治疗水平;将VEGF途径活化剂的治疗有效量投与该对象;及确认该对象组织退化的后治疗水平。41.根据权利要求40所述的方法,其中组织退化的减少表明该VEGF途径活化剂是有效的。42.根据权利要求40所述的方法,其中组织退化的该预治疗水平与后治疗水平是在疾病组织中确认。43.根据权利要求40所述的方法,其中该疾病组织是胎儿、肺脏、心脏、肝脏、脉管系统或神经组织的一个或多个。44.根据权利要求43所述的方法,其中脉管系统是一个或多个的心室微血管形成以增加侧肢循环血流至该心脏或其他组织。45.根据权利要求40所述的方法,其中该组织退化水平是通过PECAM-1表达、GalT-V表达、管子形成或LacCer水平确认。46.一种供确认候选VEGF途径活化剂治疗组织退化的治疗能力的方法,包括:提供细胞群;将该细胞接触候选组合物,及确认该候选组合物在PECAM-1表达、GalT-V表达、管子形成或LacCer水平的一个或多个的效果,其中在一个或多个PECAM-1表达、GalT-V表达、管子形成或LacCer水平的增加,表明该候选组合物可能是有效的。47.一种治疗患有或易感染太阳城集团血管新生疾病或症状的对象的方法,包括将治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂及VEGF途径活化剂投与该对象。48.根据权利要求47所述的方法,其中该抑制剂在特定组织缓和血管新生而该活化剂在其他组织促进生长。49.根据权利要求47所述的方法,其中该抑制剂与活化剂是涂布于或包含在生物可降解的生物高分子中。50.根据权利要求47所述的方法,其中该抑制剂与活化剂是涂布于纳米颗粒上。

说明书



【技术领域(相关申请案)】

本发明请求美国优先权,2004年8月20日申请的美国临时申请案 60/603,016,名称为藉由血管内皮生长因子及乳糖基神经酰胺修饰血 管新生之治疗方法,其所教示内容以参考资料合幷于本文。

【背景技术】

血管新生,当胚胎发育及创伤愈合时需要由存在一个该毛细血管 芽生式(sprouting),血管新生太阳城集团一系列的步骤,其中内皮细胞退化 它们的局部基底薄膜(basement membrane)。接着,该内皮细胞迁移进 入该结缔组织基质、增殖幷最后分化进入毛细管襻(capillary loop)。 当在肢体及心肌缺血的实验动物和患者中已知VEGF增大测肢循环血流 时,VEGF是血管新生的媒介物而且是有重要目的的。31再者,VEGF诱导 血管形成已经被文件证明在动脉粥样硬化症、糖尿病视网膜病变和肿 瘤转移。3-5

虽然大部分研究已经集中在血管新生VEGF的角色上,已知少部分 是太阳城集团基于关键表达型变化(phenotypic change)的机制。尤其,中性 鞘糖脂(glycosphingolipid)的角色仍然未知。乳糖基神经酰胺是中性 鞘糖脂家族的成员幷且藉由提供作为该神经结苷脂,例如单唾液酸神 经节糖苷脂(monosialoganglioside)GM3、双唾液酸神经节糖苷脂 (disialoganglioside)GD3、和globotriosyl神经酰胺 (globotriosylceramide,Gb3)与硫酸乳糖基神经酰胺(LacCer)生物合 成的前体,因此扮演重要的角色。当这些中性鞘糖脂被显示赋予不同 的生物功能,乳糖基神经酰胺(LacCer)藉由自身的能力,已太阳城集团细胞 增殖、细胞粘附及细胞迁移;这是血管新生全体地需求事件。最重要 的是,发现LacCer诱导PECAM-1基因/蛋白质表达22;开始血管新生的前 提条件。10,11

由旧有血管(血管新生(angiogenesis)和该内皮细胞(血管发 生)(vasculogenesis)分化)的该新毛细血管芽生式是健康与疾病的表 达型事件1。血管内皮生长因子(VEGF)已被认为与血官发生与血关新生 有关2。VEGF异常的表达已被记载于许多血管病理学,例如炎症、糖尿 病幷发症、心血管疾病及肿瘤转移3。VEGF结合自身受体KDR/Flk-1,在 生理学条件和人类动脉粥样硬化症去媒介对于血官新生的影响4-6。

太阳城集团血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1/CD31是本质地在内皮细胞中 表达整合蛋白。此外,PECAM-1表达于血小板、单核细胞、中心粒细胞 和特定T细胞亚群8。近来的研究透露PECAM-1在血管新生和体外内皮细 胞迁移可能的角色9,10。例如,人类内消旋内皮瘤(mesoendothelioma) 细胞系(REN)的植入(PECAM-1的缺陷)无法诱导裸鼠血管新生。相对地, REN细胞10过度表达的PECAM-1确实诱导这些裸鼠血管新生11。进一步地, 使用单克隆PECAM-1抗体抑制小鼠肿瘤血管新生12。最近,O’Brein等 人于研究揭露PECAM-1在血管新生的重要角色13。他们发现人类全长 PECAM-1cDNA的转染在REN细胞中免疫-酪氨酸相关的抑制基序(ITIM) 带有突变,抑制这些细胞迁移对VEGF的反应和无法在该活体外血管新 生试验形成管子(tube)。

太阳城集团乳糖基神经酰胺(LacCer)是鞘糖脂(GSL)家族的成员。LacCer普遍 地存在于哺乳动物组织幷在作为错合物GSLs合成前体扮演重要角色14。 此外,LacCer已被认为与关键表达型变化有关,例如哺乳类动物细胞 增殖与粘附15-21。近来,前单核(pro-monocytic)细胞系(U-937)我们已 表明藉由吸收PKCα和ε及PLA2,LacCer刺激该PECAM-1的转录表达和 蛋白质表达22。在带有家族性高胆固醇血症23患者血浆中,以及在死于 心肌梗死24,25患者动脉中的钙化和无钙化血小板已报导出LacCer的提高 水平。同样地,在带有心血管疾病26患者身上以及动脉粥样硬化症的动 物模型,例如apoE基因敲除小鼠27,指出可溶性PECAM-1的血浆水平提 高。

由于PECAM-1表达可能是VEGF诱导血管发生以及血管新生的前提 条件,还有由于LacCer可上调PECAM-1在U937细胞的表达,我们在 VEGF诱导PECAM-1表达和在人类内皮细胞血管新生上将LacCer可能成 功扮演第二信号角色合理化。在本申请案,我们揭露LacCer在媒介 VEGF诱导PECAM-1表达以及HUVECs细胞的血管新生是关键的。

因此,所述技术领域中有一需求,在找寻诊断方法、治疗和针对 血管新生筛选新治疗方法。因此,一般希望有治疗症状或藉由乳糖基 神经酰胺调整疾病的方法,例如抑制GalT-V、VEGFR、VEGF、PECAM-1 或其他途径成员去治疗或预防血管新生。

【发明内容】

本发明包含治疗及预防太阳城集团乳糖基神经酰胺(LacCer)疾病的方 法。尤其,我们发现的治疗,包含改变一个或多个LacCer合成酶 (GalT-V)、PECAM1、VEGFR或相关的途径成员活性,以治疗患有或易感 染太阳城集团由乳糖基神经酰胺造成且/或贡献的血管新生疾病或症状的对 象。本发明也太阳城集团侦测及分析化合物治疗该些症状能力的方法。

更具体而言,本发明提供治疗太阳城集团血管新生增殖疾病的方法,且 太阳城集团血管新生,例如癌症、冠状动脉心脏病、肿瘤转移、发炎血管疾 病、炎性疾病、缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)、 高血压或糖尿病。此外,本发明提供治疗太阳城集团血管新生相关组织退化 疾病,包括例如,胎儿子宫内成长、系统性硬化症、创伤愈合、缺血、 再灌注损伤、糖尿病、冠状动脉病、肿瘤生长。

在一态样,本文提供治疗患有或易感染血管新生对象的方法,包 括将治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂投与对象。

在一实施例,该血管新生是太阳城集团癌症、冠状动脉心脏病、肿瘤转 移、发炎血管疾病、或糖尿病。

太阳城集团在另一实施例,该VEGF途径包括一个或多个乳糖基神经酰胺合成 酶(LacCer合成酶,例如GalT-V/VI)、血管内皮生长因子(VEGF)、血 管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、 磷脂酶A2(PLA2)及乳糖基神经酰胺(LacCer)的介入或相互作用。

根据一实施例,方法可能进一步包括识别该对象所需的血管新生 治疗。在一相关实施例,该对象所需治疗的识别,包括癌症、冠状动 脉心脏病、肿瘤转移、发炎血管疾病、缺血-再灌注损伤、高血压、或 糖尿病的诊断。

在另一实施例,VEGF抑制剂及/或活化剂藉由包覆植入型医学装置 投与,例如生物降解生物高分子支架。在另一实施例,VEGF抑制剂及/ 或活化剂是经由支架或导管投与。

太阳城集团根据另一态样,确认该VEGF途径抑制剂或活化剂(例如,调整剂) 降低对象血管新生的治疗能力的方法,是提供且包括对对象实施侵入 性手术;对对象投与VEGF途径抑制剂;及测试对象血管生长。

在一实施例,使用如肿瘤异体移植的动物模型去确认该VEGF途径 抑制剂或活化剂的治疗能力。

太阳城集团在另一态样,呈现了确认该候选VEGF途径抑制剂治疗太阳城集团血管新 生疾病或症状的治疗能力的方法,幷包括提供细胞群;将该细胞接触 候选组合物,并确认该候选组合物对一个或多个的PECAM-1表达、 GalT-V表达、管子形成(例如,体外血管新生试验)、或LacCer水平的 影响。

太阳城集团根据一实施例,方法进一步地包括,在该细胞接触该候选化合物 前将该细胞接触VEGF。

根据另一态样,治疗患有或易感染组织退化对象的方法,包括对 该对象投与有效量的血管内皮生长因子(VEGF)途径活化剂。

太阳城集团在一实施例,该组织退化是太阳城集团胎儿子宫内生长、系统系硬化症、 创伤愈合、缺血、再灌注损伤、糖尿病、冠状动脉病、肿瘤生长。

太阳城集团在一态样中,提供确认该VEGF途径活化剂降低对象组织退化的治 疗能力的方法,幷包括在对象体内投与组织退化的预治疗水平;

对该对象投与治疗有效量的VEGF途径活化剂;幷确认对象组织退 化的后治疗水平。

太阳城集团根据一态样,组织退化的减少表明该VEGF途径活化剂是有效的。 根据相关的态样,该组织退化的预治疗和后治疗水平是在有病组织内 确认。

太阳城集团在相关实施例,该有病组织是一个或多个的胎儿、肺脏、心脏、 肝脏、脉管系统(例如,心室微血管形成增加了侧肢循环血流至该心脏 或其他组织)或神经组织。

太阳城集团在一实施例,该组织退化水平是藉由PECAM-1表达、GalT-V表达、 管子形成、或LacCer水平确认。

太阳城集团在另一态样,提供的是供确认治疗组织退化的该候选VEGF途径活 化剂的治疗能力,包括提供细胞群;将该细胞接触候选组合物,并确 认该候选组合物对一个或多个的PECAM-1表达、GalT-V表达、管子形 成或LacCer水平的影响,其中一个或多个PECAM-1表达、GalT-V表达、 管子形成、或LacCer水平的增加表明该候选组合物可能是有效的。。

在一态样,该VEGF途径抑制剂和活化剂组合投与的方法去治疗血 管新生相关症状。在一实施例,生物降解生物高分子可能以抑制剂和 活化剂的组合包覆着幷以太阳城集团依赖方法投与。在另一实施例,该抑制 剂及/或活化剂可能涂布在奈米颗粒上以供用于单一疗法或组合疗法。

本发明的治疗对于治疗和避免不期望的血管新生是尤其有效的。 参照下列例子中提出的结果。

本发明的治疗方法,一般包括将治疗有效量的化合物投与对象, 尤其是哺乳动物,例如灵长类,特别是人类,幷可改变下列的活性, 例如抑制LacCer合成酶(GalT-V/VI)、PECAM1、VEGFR、VEGF、PLA2或 相关途径成员,治疗患有或易感染由血管新生造成或贡献症状的患者。 较佳地,投与的化合物藉由在标准体外细胞增殖试验中至少约15%或 25%抑制血管新生。这试验的例子在下面叙述。普遍较佳地是该投与的 化合物在下面叙述的标准体外VEGF途径试验中使用至少约500μM的 IC50,更佳地是少于或约100μM的IC50,在更好地是在下面叙述的标准 体外VEGF途径试验中使用少于或约1-10μM的IC50。可抑制GalT-V活性 的该化合物通常在本文是指「VEGF途径抑制剂」或其他相似名称。

适合用于本发明血管新生抑制治疗方法的化合物,包含如通式I:

太阳城集团其中R和R1是独立地选自氢或有取代或未取代的直链或支链C1-C6烷 基所组成的群组,且进一步地其中R和R1可能被连接形成5、6或7-元 环;

R2是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C6-C30烷基所组成的 群组;且

R3是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C6-C20烷基或芳基或 取代的芳基所组成的群组;其中该取代基是卤素、C1-C4烷氧基、亚甲 二氧基、C1-C4巯基、氨基或取代的氨基,该氨基取代基可能是C1-C4烷 基、或其医药上可接受的盐。

在特定实施例,R和R1被连接形成5、6或7-元环。相关实施例中, R和R1被连接去形成吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、或氮杂 环庚基环。

用于本发明治疗方法特别好的抑制剂化合物是一个或多个的1-苯 基-2-癸酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇;

太阳城集团1-苯基-2-十六酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇;

1-苯基-2-十六酰氨基-3-哌啶基-1-丙醇;

1-苯基-2-十六酰氨基-3-吡咯烷基-1-丙醇;

1-吗啉基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯;

太阳城集团1-吡咯烷基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯;(1R,2R)-1-苯基 -2-癸酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇(D-PDMP);或反式-(2R,3R)-1-吡咯烷 基-2-十六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯、氯化白屈菜红碱 (chelerythrinbe)。

用于本发明方法特别好的抑制剂化合物是(1R,2R)-1-苯基-2-癸 酰氨基-3-吗啉基-1-丙醇(D-PDMP)、反式-(2R,3R)-1-吡咯烷基-2-十 六酰氨基-3-羟基十八碳-4,5-烯、氯化白屈菜红碱、G6976、G6850、 溴代苯甲酰甲基溴(BMB)、甲基-花生四酰基-氟磷酸酯(MAFP)、吡咯烷 基二硫代羧酸(pyrrolidine carbodithioicacid)、氯化二亚苯基碘及 N-乙酰基-L-半胱氨酸。

其他适合的抑制剂包含PECAM-1、LacCer、或VEGF途径抗体。还 包含的是VEGF途径肽和RNAi分子。

太阳城集团适合用于本发明活化血管新生治疗方法的化合物,包含如下通式 I的L异构物:

其中R、R1、R2和R3如上所述。

其他适合的VEGF途径抑制剂或活化剂化合物可容易地藉由样品测 试识别,例如体外候选抑制剂化合物测试相较于抑制或活化该VEGF途 径活性能力的控制组,例如抑制或活化至少一个途径成员的活性至少 多于控制组10%。

本发明进一步太阳城集团侦测和分析化合物抑制或活化VEGF途径与表达 治疗或避免上述症状的治疗能力的方法。较佳的侦测和分析方法,包 含在体外和体内试验二者去确认该试剂调整VEGF反应细胞的治疗能 力。

太阳城集团根据本发明较佳的体外侦测试验表明一个或多个太阳城集团VEGF相关途 径步骤。该试验包含下列步骤1)至4):

太阳城集团1)用VEGF培养VEGF反应细胞群;

太阳城集团2)将已知或候选VEGF途径抑制剂加入该细胞;

太阳城集团3)测量VEGF相关步骤中明确细胞分子的活性;及

太阳城集团4)确认该已知或候选VEGF途径抑制剂在细胞上的效果,例如、 细胞增殖、粘附、一个或多个VEGF途径成员蛋白质的表达、或管子形 成。

太阳城集团那试验可有效地测量该VEGF途径抑制剂或活化剂分别地减少或增 加VEGF途径活性的能力。参照本文「标准体外VEGF途径试验」或其 他相似用语是太阳城集团上述步骤1)至4),当在上述步骤3)中测量的明确 细胞分子是VEGF途径。如下更详细的叙述,其他本发明体外试验是在 VEGF相关步骤或途径中测量额外明确细胞分子。该本发明体外试验可 实施于接近任合反应LacCer的细胞群,包括如该细胞或组织的裂解液、 或本质上该裂解液的纯化部分。可能应用在该试验的合适LacCer反应 细胞包括,涉及血管内膜细胞、尤其是初代及/或永生化(immortalized) 内皮和平滑肌细胞,以及特定免疫细胞如白血球。较佳的LacCer裂解 液或亚细胞部分是包含VEGF途径。

本发明体外侦测试验可应用于用途。例如,如上所述,发现VEGF 表现某基因改变和蛋白表达水平以及细胞功能。因此,上述该标准体 外试验可在步骤3)调整,包含测量反应添加VEGF的细胞增殖或粘附, 及确认该VEGF途径抑制剂在细胞功能上的影响。在试验中测试的该已 知或候选VEGF途径抑制剂可作为单一活性试剂或与包含测试的VEGF 途径抑制剂的其他试剂组合。大部分的例子中,该体外试验与适合的 控制试验实施,通常包括如上述步骤相同的测试条件,但不包括添加 该VEGF途径抑制剂到该媒介物。在这例子,可藉由显示比控制组有至 少约10%较大的活性,将候选VEGF途径抑制剂是别为显示出期望的活 性;较佳地比控制组试验有至少约20%较大的活性;且再更佳地比控制 组有至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%或200% 较大的活性。活化剂在活化作用上将具有相似的活性。

太阳城集团本发明也提供侦测VEGF反应细胞试验,该细胞可能被用于,例如 上述本发明的试验。例如可能的VEGF反应细胞可藉由LacCer接触, 且接着测量之前讨论的VEGF相关蛋白中期望细胞分子或功能,如添加 LacCer剂量的功能。大部分的例子中,如果该应用的试验显示在本文 提供的试验确认中,该分子或细胞功能的活性改变至少约10%、较佳地 至少20%、更佳地至少50%、且再更佳地至少约75%或100%,那么该细 胞被认为对LacCer有反应。该试验也可被使用去识别再不同细胞或组 织中VEGF反应,包括培养后细胞(例如初代细胞或永生化细胞)及器官。

本发明也提供体内试验去确认已知或候选VEGF途径抑制剂调整细 胞功能的治疗能力,该细胞功能是藉由VEGF,例如细胞增殖和粘附及 VEGF途径成员的基因和蛋白质表达水平所影响。该监控的适合细胞功 能可能在该测试动物中旧有存在的,或该细胞功能可能藉由例如像血 管修复术的侵入性手术诱导。可在这些方法中适合地试验的细胞功能 包括,例如血管细胞增殖和粘附以及血管重构。

本发明的该体内试验可以一些方法调整所需要的试验。例如,在 本发明特定实施例,该血管分析是随着该动物在体外试验或或想要在 体内试验。在其他实施例,对动物投与作为单一活性试剂或与其他活 性化合物(例如,普罗布考(probucol))组合的该VEGF途径抑制剂,包 括测试其他VEGF途径抑制剂,大部分实施例,将在实施的体内试验中 该VEGF途径抑制剂的活性比较适合的控制组(例如假手术 (sham-operated)动物),该控制组是以如同该测试试验实施,但对该 测试对象不投与该VEGF途径抑制剂。可使用各种的测试对象,尤其是 哺乳类动物,例如兔子、灵长类、各种啮齿动物或该类似的对象。

如上所述,该侦测试验(体外或体内)可实施于广泛不同的VEGF反 应细胞、组织或器官。进一步地,该试验可藉由测试目标分子活性以 及VEGF相关途径功能去侦测有用的VEGF途径抑制剂。因此,本发明 试验可在各种细胞、组织及设置器官中测量活性。

值得注意的是,多重侦测试验(例如该体外及/或体内试验的组合) 与单一VEGF途径抑制剂的使用可扩大期望侦测的选择性与敏感度。

太阳城集团这样宽光谱测试提供额外的优点,因此,例如,在本发明体外试 验可有效执行多种分析,因此增加识别VEGF途径抑制剂治疗能力的效 率及与机率。当有大量的化合物需要测试时这是特别有用的。举例而 言,可藉由包含组合类型化学操作的标准合成方法设立VEGF途径抑制 剂的资料查询系统,幷接着测试本发明。

此外,许多的该VEGF相关步骤是VEGF途径的「下游」,而因此该 包含分子和细胞功能的试验是VEGF途径的活性下游。于是,适度但显 著的VEGF途径活性改变可纪录成可容易测试信号。

太阳城集团在一态样中,确认VEGF途径抑制剂降低对象血管新生的治疗能力 的方法,包括确认对象血管新生的预治疗水平;将治疗有效量的VEGF 途径抑制剂投与对象;幷确认对象血管新生的后治疗水平。在一实施 例,血管新生的减少表明该VEGF途径抑制较是有效的。相关实施例中, 该血管新生的预治疗和后治疗水平是在疾病组织中确认的。

本发明其他态样在下文中讨论。

【附图说明】

图1显示VEGF在PECAM-1 mRNA转录及在HUVECs的蛋白质表达的 浓度与太阳城集团依赖作用的影响,(A)细胞是以不同浓度的VEGF(0至 30ng/ml)治疗4小时。全部的RNA由被VEGF治疗的细胞中萃取,且使 用等量的全部RNA作为内部控制的实时(real-time)RT-PCR b-肌动蛋 白(b-actin)去检查等量的cDNA。(B)执行定量实时RT-PCR分析以精确 确认在PECAM-1的基因表达变化,在不同太阳城集团点以VEGF(25ng/ml)治疗 HUVECs。(C)在HUVECs以不同浓度的VEGF治疗4小时的PECAM-1西方 转渍(Western blot)分析。底部区块显示蛋白质表达的密度定量。(D) PECAM-1表达的西方转渍(Western blot)分析去确定在PECAM-1表达上 VEGF(25ng/ml)的太阳城集团进程。底部区块显示该蛋白质表现的密度定量。 所示图示是三重测定产生类似结果的实验典型而且以块状图示呈现的 该数值是平均数±标准方差(±S.D)。

图2显示VEGF刺激以及D-PDMP抑制了HUVECs中LacCer/GlcCer生物 合成与PECAM-1表达。(A)在37℃以[14C]棕榈酸盐代谢性标记细胞24 小时。接着,清洗该细胞并培养60分钟(与dD-PDMP一起或没有 (20μM))。接着加入VEGF(25ng/ml)在37℃继续培养。在指示的太阳城集团间 隔,以PBS清洗细胞三次并萃取脂质并如在前述材料与以及材料章节确 定LACCer含量。该控制值(DMSO);(载体治疗的细胞)分别对于 LacCer(区块A)与GlcCer(区块B)的质量是21.76nmol/mg蛋白质以及 9.77nmol/mg蛋白质。每个点代表以二重测定执行的三个个别实验的平 均数±标准方差(±S.D)。开口范围(□)表明在指示太阳城集团间隔以 VEGF(25ng/ml)治疗的细胞,而实心范围(v)表明在VEGF培养之后以 D-PDMP(20μM)预治疗的细胞。(B)以各种浓度的D-PDMP治疗90分钟的 HUVECs中,PECAM-1的西方转渍分析,接着以VEGF(25ng/ml)治疗4小 时,n=3;*P<0.001对上PBS or DMSO的载体控制组;**P<0.05 对上VEGF。(C)以VEGF(25ng/ml)治疗4小时或是以LAcCer(2.5μM)与 VEGF(25ng/ml)治疗四小时的HUVECs中,PECAM-1 mRNA表达的实时 RT-PCR分析。在一些实验,细胞是以D-PDMP(20μM)预治疗90分钟, 然后由VEGF/LacCer作4小时。n=3;*P<0.001对上 VEGF/VEGF+LacCer;**P<0.001对上载体控制组;***P<0.05对上 D-PDMP+VEGF。

太阳城集团图3显示LacCeR特定地诱导HUVECs中PECAM-1表达与管子形成/血 管新生。(A)执行PECAM-1表达以证明LacCer特定地诱导HUVECs中的 PECAM-1。以LacCer以及其同源物,例如DGDG、GlcCer或C2Cer用2.5μM 治疗细胞4小时。随后,处理细胞裂解液供西方免疫转渍分析用藉以 确定PECAM-1表达。[n=3;*P<0.001对上VC载体控制组(DMSO)]。 (B)PECAM-1表达的西方转渍分析证明LacCeR在PECAM-1表达上特定地 绕道了该D-PDMP的抑制效果(n=3,*P<0.001对上载体控制组;** P<0.05对上D-PDMP治疗的细胞)。(C)上方区块描述HUVECs中该 LacCer/VEGF诱导血管新生的效果以及LacCer特定地反转D-PDMP对于 VEGF诱导血管新生的该抑制效果。下方区块显示如「实验程序」章节 所述的该管子形成的定量测量(n=3;*P<0.001对上载体控制组细 胞;**P<0.05对上VEGF或LacCer治疗的细胞以及#P<0.05对上 区块D)。

图4证明对于HUVECs中该LacCer/VEGF诱导的PECAM-1表达与血 管新生,该PPMP的效果。(A)单独以VEGF克隆4小时或以PPMP(90分 钟)预治疗然后以LacCer或GlcCer培养4小时的细胞中,PECAM-1表 达的西方转渍分析(n=3;*P<0.001对上控制组细胞;**P<0.001 对上VEGF治疗的细胞;***P<0.05对上PPMP+GlcCer细胞)。(B) 显示在HUVECs中该VEGF/LacCer促进血管新生的效果以及该PPMP对 于VEGF诱导的血管新生的抑制效果。HUVECs是以VEGF(25ng/ml)治 疗4小时或以D-PDMP(20μM)治疗90分钟,接着以VEGF(25ng/ml)、 GlcCer(2.5μM)或LacCer(2.5μM)培养4小时,并如前述内容执 行体外血管新生试验。(n=3;*P<0.001对上载体控制组PBS或DMSO A;**P<0.001对上VEGF或LacCer;***P<0.05对上PPMP+VEGF; #P<0.001对上PPMP+VEGF)。

太阳城集团图5显示使用siRNA用于抗人类GalT-V的该GalT-V表达沉默。 (A)描述执行免疫转渍分析去证明该兔子多克隆抗人类GalT-V的专一 性。通道1至2,是HUVECs的细胞裂解液,而通道3至4是充满CHO-K1(MT) 细胞过表达人类GalT-V。(B)以标靶对抗GalT-V的、零乱序列的(负控 制siRNA)或单独以OF转染试剂(Oligofectamine)的该双螺旋siRNA 指示浓度转染HUVECs。如图所示,接着,转染后48小时收取裂解的细 胞,并藉由带有GalT-V抗体或b-肌动蛋白的免疫转渍探针分析GalT-V 蛋白质水平。当以b-肌动蛋白表达作标准化,GalT-V表达是以%控制 表示,且该相对定量值显示在该免疫转渍下。(C)HUVECs是以零乱的 GalT-V siRNA(100nM)或GalT-V siRNA(100nM)转染。转染后48小时, 将细胞裂解且以「材料与方法」所述去执行Cer合成酶的酶活性。所 显示的该数据是产生类似结果的两个相同实验典型。(*P<0.05对上 零乱的GalT-V siRNA或单独的OF)。

太阳城集团图6证明GalT-V的沉默减弱了HUVECs中VEGF诱导的PECAM-1表 达与血管新生。(A)HUVECs中PECAM-1蛋白质表达的免疫转渍分析是以 特定供GalT-V的siRNA转染或以零乱的siRNA(负控制)作转染,并以 或不以VEGF(25ng/ml)治疗4小时。当以b-肌动蛋白标准化,括号内 指示的数值是PECAM-1蛋白质水平的定量表达。(B)描述细胞中血管新 生试验,该细胞是以GalT-V siRNA转染或零乱的siRNA转染并接着以 VEGF(25ng/ml)治疗4小时。(C)描述管子形成的定量测量。将该前述 实验以二重测定重复,而且所显示的免疫转渍是其产生可再现结果的 典型。

图7显示PECAM-1是LacCer/VEGF诱导的血管新生所需。(A)HUVECs 是以SU1498预治疗1小时或者以抗人类PECAM-1 mAb预治疗1小时, 并接着施以VEGF(25ng/ml)/LacCer(2.5μM)4小时,并接着如前述「材 料与方法」章节实施管子形成试验。(B)描述管子形成的定量分析。((n =3);*P<0.001对上遭受PBS或DMSO的载体控制组;**P<0.001 对上VEGF)。

图8证明缺乏该PECAM-1无法在体外诱导血管新生。REN(WT)[A] 是以VEGF(25ng/ml)[B]、LacCer(2.5μM)[C]或REN(rhPECAM-1)[D]刺 激4小时,并接着如前述执行在体外血管新生试验。这里所显示的结 果是由三重测定执行的实验组产生类似的结果。

【具体实施方式】

太阳城集团如上文讨论,是本发明供治疗与避免血管新生相关症状治疗方法的特 征。本发明治疗方法一般包括将治疗有效量的VEGF途径调整剂投与对 象(例如抑制剂或活化剂),较佳地是患者所需治疗。

同样意外地发现VEGF是细胞信号分子,可调整各种血管新生相关 症状。即是,VEGF途径成员的细胞水平中变化改变那些疾病的严重性 与发展。尤其意外地发现在VEGF反应细胞中,VEGF作用为信号分子影 响特定细胞步骤(有时候在本文中表明为「VEGF相关步骤」或「VEGF 相关途径」)的变化。VEGF相关途径影响各种相太阳城集团血管新生的功能。

本文中对LacCer合成酶的命名如下:起初,LacCer合成酶是由人 类肾脏纯化并以其为特征。后来,Nomura et al.,(J Bio Chem.1998; 273:1357013577.)克隆老鼠大脑的LacCer合成酶并称为 GalT-2/GalT-IV。接着,由Gen Bank分析资料并揭露其他b 1-4半乳 二糖转移的存在(Glycobiology.1998;8:517-526),幷与老鼠大脑 的LacCer合成酶具有~68%的相似度。该LacCer合成酶被称为GalT-V。 根据生物化学与功能研究,建议GalT-V是真实的LacCer合成酶 (Kolmakova A.and Chatterjee S.Glycoconjugate J.2005 in Press)。 根据RT-PCR与北方转渍(Northern blot)分析,在HUVECs中GalTt-V 是主要的LacCer合成酶(Kolmakova A.and Chatterjee S. Glycoconjugate J.2005 in Press),因此在原稿中我们使用该术语 GalT-V以明确表明该HUVEC酶。当我们还不确定使否该酶是GalT-V 或GalT-VI,我们已表明它是LacCer合成酶。

「提供多肽」表明为藉由例如购买或制造该多肽取得。该多肽可 能由任何已知或晚近发展的生物技术制得。例如,该多肽可由被培养 的细胞取得。该培养的细胞,例如可能包括表达构成,该表达构成包 括核酸片段编码的多肽。

细胞及/或对象可能以一个或多个抗血管新生治疗去治疗及/或接 触,包括手术、化疗、放射疗法、基因疗法、免疫疗法或荷尔蒙疗法、 或其他由自己或医疗照顾提供者健抑或禁止的疗法。

本文中使用的「治疗、避免或减轻血管新生」表明本文中所述的 该治疗剂预防疾病或治疗的使用,例如VEGF途径抑制剂。

本文某些例子中使用的「血管新生」表明由异常血管新生的例子 造成的或相关的症状。换言之就是异常的增加或减少血管新生。涉及 增加的血管新生症状,包含例如,血管新生是太阳城集团癌症、冠状动脉心 脏病、肿瘤转移、发炎血管疾病、炎性疾病、缺血-再灌注损伤、高血 压或糖尿病。涉及增加的血管新生的这些症状是表明本文中以VEGF途 径抑制剂治疗。相太阳城集团减少的血管新生症状,包含例如组织退化是相 太阳城集团胎儿子宫内成长、系统性硬化症、创伤愈合、缺血、再灌注损伤、 糖尿病、冠状动脉病、肿瘤生长。相太阳城集团减少的血管新生的这些症状 是表明本文中以VEGF途径抑制剂治疗。

本文中使用的「VEGF途径」和「VEGF途径成员」描述蛋白质与其 他信号分子是对细胞的VEGF刺激有反应。例如,VEGFR、PECAM-1、LacCer 合成酶及PLA2。

本文中使用多肽、或其片段或变化物的「降低水平」表明特定细 胞或对对象表现的较低的平均值、期望的或实际较低值。

太阳城集团当在多肽、或其片段或变化物的上下文中使用「本质上纯化」是 表明至少60%、较佳地75%与更佳地90%没有其他彼此相关的成分。因 此,「分离的多肽」是本质上纯化的多肽。

太阳城集团该术语「对象」包含可能患有血管新生的有机体或可在其他方面 受惠于投与本发明化合物或组合物者,例如人类或非人类动物。较佳 的人类动物,包含本文所述的患有或有血管新生或关连状态倾向的人 类患者。本发明中该术语「非人类动物」包含所有的脊椎动物,例如 哺乳类动物、例如啮齿目动物、例如小鼠、及非哺乳类动物,例如非 人类灵长类动物、例如羊、狗、牛、鸡、两栖类、爬虫类等等。

本文中使用「预测或诊断」方法表明基于观察,对象的症状临床 或其他试验、测试或其他有关事项。

太阳城集团「确认表达的水平」可能是藉由任何目前已知或此后发展的确认 表达水平试验或方法,例如免疫技术、PCR技术、免疫试验、定量免疫 试验、西方转渍或ELISA、定量RT-PCR、及/或北方转渍法。该水平可 能是RNA或蛋白质的。

一个或多个的样品可能藉由,例如擦拭、切片、洗濯或刺络从对 象取得。样品包含组织样品、血液、唾液、支气管洗涤物、针吸式活 组织(biopsy aspirate)、或乳管灌洗样品。

太阳城集团本文中使用「治疗有效量」表明基于对于该细胞或对象投与单一 或多剂量试剂的剂量是有效的,在患有该疾病的患者的存活能力或延 长存活能力上超越没有该治疗的期望。

太阳城集团本文中所述的组合物可能是藉由例如全身性地、瘤内地、血管内、 切除肿瘤基部、口服地或藉由吸入投与。

太阳城集团本文中使用该术语「引物」表明寡核苷酸,不论自然发生于纯化 的限制性酶或合成制造的,当置放在引物延伸产物合成物中是可作用 为合成开始的点,该产物是互补于诱导的核酸链(例如在核苷酸与例如 DNA聚合酶的诱导剂的存在下,与适合的温度与pH)。该引物较佳地为 在扩增最大效率是单链但可替代的是双链。如果是双链,该引物在用 于制备延伸产物前是被首次用于分离自身链。该引物在诱导剂的存在 下必定是足够长度去启动延伸产物的合成。该引物的精确长度视许多 因素而定,包括温度、引物的来源及该方法的使用。

太阳城集团除非另有表明,特定核酸序列同样暗示包含其谨慎修饰的变化物 (简幷密码子取代物)与互补序列,且该序列是明确地表明。尤其,简 幷密码子取代物可能藉由回折(degenerating)序列完成,一个或多个 选择的(或全部)密码子的第3位置是被混合碱及/或脱氧肌苷残基取代 (Batzer et al.,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Boil.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol. Cell Probes,8:91-98(1994))。该项核酸是与基因、cDNA、mRNA、 寡核苷酸、及多核苷酸互换地使用。

在本文中互换地使用该术语「多肽」、「肽」及「蛋白质」,表明氨 基酸残基的高分子。该术语应用于氨基酸高分子,一个或多个的氨基 酸对应自然存在氨基酸是人工化学的拟态,同样也应用于自然存在的 氨基酸雨非自然存在的氨基酸。

在本文中使用该术语「聚合酶链反应」(PCR)表明美国专利第 4683195、4683202及4965188的方法,其全部内容幷入本文以兹参考, 该术语是太阳城集团在没有克隆或增殖的基因组(enomic)DNA混合物中增加 标靶序列片段的浓度。在本文中使用该术语「PCR产物」及「扩增产物」 表明太阳城集团经过该PCR变性、退火与延伸步骤二个或更多个的循环完成 后的化合物结果混合物。这些术语包含已有一个或多个目标序列的一 个或多个片段扩增化例子。

本文中使用的该术语「限制性内切酶(restriction endonuclease)」及「限制性酶」是表明太阳城集团细菌酶,在或接近特定核 苷酸序列每个细菌酶切断双链DNA。

太阳城集团本文中使用的该术语「重组DNA分子」是表明太阳城集团藉由分子生物 技术将DNA片段所组成的DNA分子连接在一起。

本文中使用的核酸序列,即使是较大的寡核苷酸内部,也可能被 认为具有5’和3’终端。在线状或环状DNA分子,分开的元素是表明 为「上游」或「下游」的5’端或3’元素。这术语所表现的事实是在 顺着DNA链5’至3’方式进行转录。指挥连结基因转录的该启动子和 增强子元素通常是位于5’端或该编码区的上游。然而,增强子元素可 运用其影响,即使是当位于该编码区和该启动子元素的3’端的时候。 转录结束及多聚腺苷酸化信号是位于3’端或该编码区的下游。

本文中使用的具有核苷酸序列编码基因的核苷酸是指包括基因的 该编码区的DNA序列或换言之的DNA序列编码基因产物。该编码区可 能出现在cDNA或基因组DNA形式。如果需要允许适当转录开始及/或 恰当的初级RNA转录进行,适合的控制元件(element)例如增强子/启 动子、剪接接口、多聚腺苷酸化信号等等,可能被置于接近该基因编 码区附近。可选择地,在本发明载体使用的该编码区可能包含内源增 强子/启动子、剪接接口、间隔序列、多聚腺苷酸化信号等等,或内源 与外源控制元件二者的组合。

太阳城集团在2个或更多个核酸或多肽序列的上下文中,该术语「相同」或 百分比「相同」是指当在比对谱窗(comparison window)比对和对齐最 大一致性时或当使用一种下列序列比对演算或藉由手动对齐和目测测 量指定区,2个或更多个序列或子序列(subsequence)是相同的或具有 氨基酸残基或核苷酸的特定百分比是相同的(例如特定区域60%相同、 视情况地65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%相同)。那么该序列 可认为是「本质上相同」。这定义也是指对测试序列的认可。视情况地, 存在区域上的相同是至少50个氨基酸或核苷酸长度相同,或更佳地区 域上是75至100个氨基酸或核苷酸长度相同。

太阳城集团序列比对,典型地依序列作为参考序列,幷比对测试序列。当使 用序列比对演算法,测试和参考序列都输入电脑,如果需要的话,指 定序列调节,幷指定序列演算程序参数。可使用预设的程序参数或者 可指定替代的参数。该序列比对演算法根据程序参数可由该测试序列 相对于参考序列计算序列相同百分比。

本文中使用「比对谱窗」包含参考任一数量的连续位置片段,该 连续位置是选自20至600,通常约50至约200,更常为约100至约150 个组成的群组,在两个序列以最佳化对齐后,群组中序列可能与连续 位置的相同数量的参考序列比对。供比对的序列对齐方法在所属领域 中是已知的。供比对序列的最佳化对齐可藉由Smith&Waterman的局 部相似(local homology)演算法执行,Adv.Appl.Math.,2:482 (1981);藉由Needleman&Wunsuh该相似对齐演算法,J.Mol Biol., 48:443(1970);藉由Pearson&Lipman的相似方法检索,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.,85:2444(1988);藉由这些演算法的电脑化完成 (GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr., Madison,Wis.);或藉由手动对齐与目测(参考,例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995 supplement))。

本文中使用该术语「抗体」是指任何具有特定免疫反应性的分子, 不论是否与其他化合物偶合,例如目标(target ing)试剂、载体、标签、 毒素、或药物。虽然抗体通常包含2个轻的和2个重的链聚集在「Y」 结构中,它们之间有或无共价键连结,该术语同样太阳城集团包含任何平常 化合物的活性片段,例如Fab分子、Fab蛋白质或具有结合抗原亲和力 的单链多肽。Fab是指抗原结合片段。本文中使用的该术语「Fab分子」 是指抗体分子的区域包含重链及/或轻链的各种部分,幷表现出结合活 性。「Fab蛋白质」包含一重链与一轻链(一般认为Fab)的聚集,以及相 当于该抗体Y(一般认为F(ab)2)的两个分支的四聚体,不论上述哪一种 是共价键或非共价键聚集只要该聚集是有能力选择与特定抗原或抗原 家族反应即可。

本文中以广义使用该术语「抗体」,幷包含多克隆及单克隆抗体二 者,除了完整的免疫球蛋白分子外,该术语「抗体」还包含是那些免 疫球蛋白分子的片段或高分子,及免疫球蛋白分子的人类或人源化形 式或其片段,只要它们是选择其能力与本文中所述的该蛋白相互作用。 在根据已知临床测试方法该抗体的体外治疗及/或预防疾病的活性被 测试后,该抗体可藉由使用本文所述的体外试验测试其期望活性,或 藉由类似方法。

太阳城集团本发明的该抗体被提出对抗VEGF途径成员,例如VEGF、VEGFR、 VEGF途径、PECAM-1。

该抗体可为多克隆、单克隆、重组的、例如嵌合或人源化、全人 类、非人类,例如鼠类、单链抗体、或全合成的。嵌合的、人源化, 但最佳地完全人类抗体是包含重复投与的应用所期望的,例如人类患 者的治疗,及一些诊断应用。相关实施例中,该抗体可与毒素偶合。

治疗方法与组合物

太阳城集团本发明提供治疗患有或具有血管新生风险对象的预防疾病和治疗 方法。

太阳城集团本发明进一步提供在对象体内治疗血管新生的方法,包括将对向 投与一个或多个剂量的本发明医药组合物,幷有效降低对象血管新生, 因此治疗该血管新生。

本文中使用该术语「血管新生相关疾病」及「异常血管新生」是 表明无症状期和症状期二者、及增加的血管新生(癌症、冠状动脉心脏 病、肿瘤转移、发炎血管疾病、或糖尿病)及减少的血管新生(组织退 化)。

太阳城集团本文中使用的「异常血管新生」表明增加的血管新生(例如癌症、 冠状动脉心脏病、肿瘤转移、发炎血管疾病、或糖尿病)及减少的血 管新生(组织退化)。

本文中使用该术语「治疗」定义为对患者应用或投与治疗剂,或 对患者的分离组织或细胞系应用或投与治疗剂,该患者是患有或具有 异常血管新生风险的,该术语幷带有治疗、治愈、减轻、缓和、改变、 医治、改善、改进或影响该染病或染病的症状。治疗剂包括但不限于, 如本文所述的肽、抗体或其片段、小分子、脂质及核酸。

该术语「有效量」表明剂量或数量是足以减低或增加血管新生的 数量,幷导致患者症状改善或达成所期望的生物结果,例如较佳或较 高的血管新生。

太阳城集团「医药上可接受的赋型剂或载剂」包括,例如水、盐、甘油、乙 醇等等。此外,辅助物质,例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物、及其相 似物可能出现在该载剂中。

本发明治疗方法普遍地包括对需要该治疗的对象投与治疗有效量 的VEGF途径抑制剂或活化剂,例如哺乳类动物,及尤其是灵长类,例 如人类。本发明的治疗方法同样包括将需要本文揭露治疗的对象投与 如本文定义有效量的通式I化合物,该对象尤其是哺乳类动物,例如 人类。

太阳城集团各种的VEGF途径抑制剂可使用在本治疗方法。简单的测试,如上 述定义的标准体外试验可轻易地识别适合的VEGF途径抑制剂。较佳的 VEGF途径抑制剂包含那些含有丙醇主链者。一般供本发明治疗方法使 用的较佳化合物如通式I:

其中R和R1是独立地选自氢或有取代或未取代(例如氨基、羟基或巯 基)的直链或支链C1-C6烷基所组成的群组,且进一步地其中R和R1可能被 连接形成5、6或7-元环取代基,例如吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基、 呱啶基、或氮杂环庚基及其类似物;

R2是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C6-C30烷基所组成的 群组;且

R3是选自是选自有或没有1至3个双键的直链或支链C6-C20烷基或 芳基,例如碳环芳基(例如苯基)或取代的芳基,例如碳环芳基(例如苯 基)所组成的群组;其中该取代基是卤素、C1-C4烷氧基、亚甲二氧基、 C1-C4巯基、氨基或取代的氨基,该氨基取代基可能是C1-C4烷基。

上述通式I适合的化合物及其他VEGF途径抑制剂可轻易地藉由已 知程序制备或可由市场资源上取得。参照,例如Abe,A.et al.,(1992) J.Biochem.111:191-196;Inokuchi,J.et al.(1987)J.Lipid Res. 28:565-571;Shukla,A.et al.(1991)J.Lipid Res.32:73; Vunnam,R.R.et al.,(1980)Chem.AndPhysics ofLipids 26:265; Carson,K.et al.,(1994)Tetrahedron Lets.35:2659;and Akira, A.et al.,(1995)J.Lipid Research 36:611。

VEGF途径抑制剂也包含,例如SU-1498、G6976、G6850、溴代 苯甲酰甲基溴(BMB)、甲基-花生四酰基-氟磷酸酯(MAFP)、吡咯烷基二 硫代羧酸、氯化二亚苯基碘及N-乙酰基-L-半胱氨酸。

VEGF途径抑制剂也包含,例如PECAM-1、LacCer、或LacCer合成 酶抗体或其片段。例示性的抗体,包含特定对于减轻的VEF-诱导的体 外血管新生/管子形成的LacCer合成酶(GalT-V/VI)抗体。其他供本文 所述使用的例示性抗体是特定GalT-V肽序列,包括 IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND及IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT。进一步在 本文所述的方法有用的抗体是特定针对下列LacCer合成酶(GalT-V/VI) 序列:

人类GalT-V肽

太阳城集团(115)PERLP(119)

(145)PTIKLGGHWKP(155)

太阳城集团(160)PRWKVAILIP(169)

太阳城集团(169)PFRNRHEHLP(178)

太阳城集团(178)PVLFRHLLP(186)

太阳城集团(316)PEGDTGKYKSIP(328)

太阳城集团人类GalT-VI肽

(97)PENFTYSP(104)

太阳城集团(104)PYLP(107)

太阳城集团(107)PCPEKLP(113)

太阳城集团(143)PGGHWRP(149)

(154)PRWKVAVLIP(163)

太阳城集团(163)PFRNRHEHLP(172)

太阳城集团(172)PIFFLHLIP(180)

(311)PEGDLGKYKSIP(322)

(374)PELAP(378)

太阳城集团VEGF途径抑制剂也包含,例如PECAM-1、LacCer、或LacCer合成 酶siRNA分子。例如5’-CGG、AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3’(正 义)、5、UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3’(反义)。

VEGF途径抑制剂也包含例如PECAM-1、LacCer、或LcaCer合成酶 肽或其片段。例示性的肽包含下列LcaCer合成酶(GalT-V/VI)肽:

人类GalT-V肽

(115)PERLP(119)

(145)PTIKLGGHWKP(155)

(160)PRWKVAILIP(169)

(196)PFRNRHEHLP(178)

太阳城集团(178)PVLFRHLLP(186)

(316)PEGDTGKYKSIP(328)

人类GalT-VI肽

(97)PENFTYSP(104)

(104)PYLP(107)

(107)PCPEKLP(113)

(143)PGGHWRP(149)

(154)PRWKVAVLIP(163)

太阳城集团(163)PFRNRHEHLP(172)

(172)PIFFLHLIP(180)

(311)PEGDLGKYKSIP(322)

(374)PELAP(378)

其他有用的肽包括PLA2肽,因为磷脂酶A2(PLA2)活化是需要藉由 LacCer去诱导PECAM-1表达(Gong,N…Chatterje,S et al Proc Natl Acad Sci USA.101;6490-6495 2004),且在本文中呈现的是PLA2抑 制剂在人类内皮细胞中也缓和VEGF/LacCer诱导的血管新生。PLA2肽 的使用在对象中可缓和PLA2活性且因此PECAM-1表达与血管新生。例 式性的PLA2肽序列包含具有CC(P)-x-H-(LGY)-x-C序列的肽,其中组 氨酸(H)是该酶的活性位置。

太阳城集团其他si-RNAs及肽是想象的且受惠于本说明书(例如序列及筛选方 法)的所属领域中人士可知道如何制造及使用其他此类VEF途径的 si-RNA及肽抑制剂。例如,si-RNA可能藉由使用下列序列建构:AF38663 (GalT-V)、AF38664(GalT-VI)、NM_008816、NM_000442(PECAM1)、 NM_077435、NM_001025370、NM_001025369、NM_001025368、 NM_001025367、NM_003376、NM_001025366、(VEGF)、X94263、XM_497921、 AB065372、AJ319908、D64016、NM_002019、(VEGFR)及NM_000300、 BC005919、(PLA2),其全部内容幷入本文以兹参考。

本发明的治疗方法,可对于对象以各种形式投与治疗化合物。例 如VE6F途径抑制剂或活化剂可以预防疾病的投与,去避免目标症状的 开始或降低其严重性。另一选择,可于目标症状的过程中投与VEGF途 径抑制剂。

太阳城集团可将单独的或一个或多个治疗剂组合的治疗化合物投与对象,如 与传统赋形剂混合物的医药组合物,例如适合经由肠外、肠内、或鼻 内使用且不会与活性化合物有不利地反应,也部会对接受者不利的医 药上可接受的有机或无机载体物质。适合的医药上可接受载体包含但 不限于水、盐溶液、酒精、蔬菜油、聚乙二醇、白明胶、乳糖、直链 淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘石腊、香料油、脂肪酸单酸甘油酯 和双酸甘油酯、petroethral脂肪酸、羟甲织维素、聚乙烯四氢咯酮等 等。该医药制备物可被消毒且若期望与辅助剂混合亦不会与活性化合 物产生有害反应,该助剂例如润滑剂、保护剂、稳定剂、湿润剂、乳 化剂、供影响渗透压之盐、缓冲剂、颜料、调味剂且/或芳香族物质和 其相似物。

该组合物可能被制备供肠外投药使用、尤其是以液体溶液或悬浮 益形式;供口服投药,尤其是以片剂或胶囊形式;供鼻内投药,尤其 是粉末、滴鼻剂、或喷雾方式;在阴道投药;局部投药例如乳液的形 式;在直肠投药例如栓剂;等等。该VEGF途径抑制剂或活化剂可能也 经由支架投药。例示性的支架描述于美国专利申请案公开号: 20050177246、20050171599、20050171597、20050171598、20050169969、 20050165474、20050163821、20050165352、及20050171593。

该医药试剂可能是传统地以单位剂量形式投药并可能藉由任何在 医药领域已知方法制备,例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa,1980)所描述。肠外给药配 方可能包含一般的赋形剂,例如无菌水或盐、聚烃基乙二醇例如聚乙 二醇、蔬菜原料油、氢化萘及其类似物。尤其,生物相容性、可生物 降解的丙交酯高分子、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯醚-聚氧 丙烯醚共聚物可能是有用的赋形剂去控制特定VEGF途径抑制剂的释 放。

太阳城集团其他潜在有用的肠外传递系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、 渗透泵、植入性灌注系统、及脂质体。吸入投药配方包含如赋形剂, 例如乳糖、或可能是含水性溶液,例如聚氧乙烯醚-9-十二烷基醚、甘 氨胆酸、脱氧胆酸或在供滴鼻剂形式投药的油性溶液、或如鼻内应用 的胶体。肠内投药的配方可能也包含供口颊给药的甘氨胆酸、供直肠 投药的甲氧基水杨酸酯、或供阴道投药的柠檬酸。其他传递系统将在 手术部位直接投与该治疗剂,例如在球囊血管修复后可能藉由使用支 架投与VEGF途径抑制剂。

太阳城集团VEGF途径调整剂(例如抑制剂或活化剂)可在本治疗方法使用作为 单一活性医药试剂或可与其他活性成分组合使用,例如普罗布考 (probucol)、已知的抗氧化剂(维他命C或E)或其他化合物。本文中使 用的调整剂是指该VEGF途径的抑制剂或活化剂。

太阳城集团治疗组合物的一个或多个治疗化合物浓度可能视一些因素变化, 包括该VEGF途径抑制剂或活化剂投与的剂量、该使用的组合物化学特 性(例如疏水性)、及预期模式和投药路径。一般条件下,供肠外投药, 以含有约0.1至10%化合物的水性生理缓冲液提供一个或多于一个 VEGF途径抑制剂活活化剂。

太阳城集团用于给予治疗上该实际较佳的活性化合物量将根据,例如使用的 特定化合物、该特别的组合物配方、该投药模式及该对象的特性而变 化,例如物种、性别、体重、一般健康状态及该对象年龄。针对给予 的投药计画,可由熟悉该项技术者使用传统剂量决定测试实施前述相 关方针轻易地确定理想投药速率。适合的剂量范围可能包含由每天体 重的1μg/kg至约100μg/kg。

太阳城集团本发明治疗化合物适合以质子化和水溶性形式给药与患者,例如 医药上可接受的盐类、典型地酸添加盐例如无机酸添加盐,例如盐酸 化物、硫酸盐、磷酸盐或如有机酸添加盐例如醋酸、顺丁烯二酸、富 马酸、或柠檬酸盐。本发明治疗化合物的医药上可接受盐同样可包含 金属盐类、尤其是如钠盐或钾盐的碱金属盐;例如镁或钙盐的碱土金 属盐;例如铵或四甲基铵盐的铵盐;或氨基酸添加盐例如赖氨酸 (lysine)、乙氨酸、或苯丙氨酸盐。

较佳的VEGF途径调整剂(例如抑制剂或活化剂)在标准细胞增值试 验展现显著的活性。较佳地,该VEGF途径抑制剂抑制细胞增殖相对于 适合的控制试验至少约15或25%,较佳地至少50%。在该试验中,使 用期望的VEGF途径抑制剂或活化剂约在0.1至100μM之间,较佳地 在约1至50μM之间。例示性的细胞增殖试验包括计算存活细胞幷监 视特定柠檬酸循环酶的活性,例如乳酸脱氢酶。

测量一个或多个可侦测标记(detectably-labeled)核苷合幷进入DNA 的较佳试验,例如藉由:

a)在介质中培养适合的细胞幷添加

太阳城集团1)候选VEGF途径抑制剂或活化剂及

2)典型地量约0.1至100μ Ci之间的放射性标记核苷,例如3H-胸苷;

b)培养该细胞,例如约6至24小时,并典型地接着清洗;及

太阳城集团c)测量该放射性核苷的合幷进入DNA超过相较于控制培养的太阳城集团,该 控制培养是如该试验培养一样以相同条件制备与培养但不包含该可能 的VEGF途径抑制剂或活化剂。该测量可藉由多种方法达成,包括再纸 滤器上标记DNA的三氯醋酸(TCA)沉淀接着进行闪烁计数。参照,例如 相太阳城集团这试验的揭露Chatterjee,S.,Biochem.Biophys.Res Comm. (1991)181:554;Chatterjee,S.et al.(1982)Eur.J.Biochem. 120:435。

参考本文「标准体外细胞增殖试验」或其他相似词语是指包含上 述步骤a)至c)的试验。较佳的细胞增殖试验例子使用主动脉平滑肌细 胞(aortic smooth muscle cells)(ASMCs),尤其由人类、牛或兔子取 得。适合的计画是太阳城集团根据标准方法制备ASMCs以及在适合的介质中 培养一些细胞,例如Ham’s F-10。期望的VEGF途径抑制剂或活化剂 是接着在介质中稀释,较佳地为每毫升介质中约1至100μg的最终浓 度,更佳地为约1至50μg或更小,接着伴随着约1至5天的培养期, 较佳缔约1天或更少。该培养之后,可执行标准细胞增殖,例如上述 提及的氚化胸苷的合幷或乳酸脱氢酶试验。该试验较佳地以三重测定 执行并带有5%至10%之间的变动。参照,例如Ross,R.J.Cell.Biol. (1971)50:172;Chatterjee,S.et al.(1982)Eur.J.Biochem. 120:435;Bergmeyer,H.V.In Principles of Enzymatic Analysis. (1978)Verlag Chemie,NY。

太阳城集团此外,较佳的VEGF途径抑制剂或活化剂在传统细胞粘附试验表现 出显著活性。较佳地,该VEGF途径抑制剂抑制细胞粘附相对于适合的 控制试验至少25%,较佳地至少50%或更多。较佳地,该VEGF途径活 化剂活化细胞粘附相对于适合的控制试验至少25%,较佳地至少50%或 更多。在该试验中,期望的VEGF途径抑制剂或活化剂是使用约0.1至 100μM之间,较佳地约1至50μM之间。举例而言,较佳的细胞粘附 试验包含下列步骤:

太阳城集团a)将第1群免疫细胞,较佳地是特定白血球细胞,标记可侦测 标签,该标签是有能力制造可侦测标签的染色的、放射性的、 发光的(例如萤光或磷光)、或酶标签,

b)将该第1群细胞接触第2群做可侦测标记的内皮细胞,例如 染色的、放射性的、发光的(例如萤光或磷光)、或酶标签, 较佳地是和步骤a)使用不同的标签;及

太阳城集团c)侦测第1和第2群细胞之间的粘附。

参考本文中「标准体外细胞粘附试验」或其他太阳城集团包含上述a) 至c)步骤试验的类似词语。在步骤c)中该侦测可藉由不同方法达成, 例如显微术、尤其是太阳城集团FACS的共焦显微术及萤光为基础的显微照相 术;自动细胞分类技术、例如ELISA及RIA的免疫学方法;及闪烁记 数。参考下列揭露相关的较佳细胞粘附试验例子。

较佳的体外细胞粘附试验是在与期望的VEGF途径抑制剂或活化剂 接触前、当时或之后测量多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte)(PMNs及/或肌细胞)或血小板及增加的内皮细胞粘附。该 PMNS或肌细胞可根据下述详细标准方法收集与纯化。该PMNS或肌细胞 接着藉由与适合的萤光染料,例如萤光细胞跟踪染料(例如绿染料)或 Calcein-AM培养做标记。在大约相同的太阳城集团,把在适合的基质上,例 如平板或无菌塑胶培养皿以标准细胞培养方法制备的内皮细胞单层藉 由该VEGF途径抑制剂或活化剂揭触,幷以另一个萤光染料例如萤光细 胞跟踪染料(例如橙染料)做标记。接着在37℃培养该PMNS或肌细胞及 内皮细胞约10分钟至几小时之间,较佳地约30分钟。接着在该平板 以生理上可接受缓冲液,例如磷酸缓冲盐(PBS)清洗掉非粘附性细胞。 接着藉由标准方法,例如使用荧光读板仪估计粘附细胞数量。平板上 的该粘附细胞数量可以数种方法估计,包括在内皮细胞单层上表达该 PMN/mm2数量。另一选择,该粘附细胞可藉由下列显微照相术使用显微 照相及目测做检查以估计数量。接着藉由显微照相术检查来评估细胞 粘附。参照下列例子。

尤其较佳的是如前述方法以及以ASMCs处理的GalT-V试验。参考 例如Chatterjee,S.,and Castiglione,E.(1987)Biochem.Biophys. Acta,923:136;及Chatterjee,(1991)S.Biochem.Biophys.Res Comm.,181:554。

特别佳地体外细胞粘附试验包含在PMNs粘附分子的免疫学侦测使 用特定有特别能力结合该粘附分子的抗体,尤其是单克隆的。特别佳 地试验是包含流式细胞术(flow cytometry)。

上述该体外粘附试验是相容于各种特定粘附分子分析,例如 ICAM-1(细胞内粘附分子1)、Mac-1(CD11b/CD18)、LFA-1及选择素 (selectin)。

另一种本发明试验,包括下列步骤a)至d):

太阳城集团a)培养VEGF-反应细胞群较佳地融合在不足脂蛋白 (lipoprotein-deficient)低血清培养基,例如约培养基的 1mg不足脂蛋白低血清/蛋白/毫升或更少;

b)较佳地在适合的分散缓冲液中,例如二甲胂酸盐缓冲液,收 取该细胞;

c)较佳地以可侦测标记分子,例如可侦测标记核苷腺苷二磷酸 供体,例如典型地量约0.1至100μCi之间的「14C」-UDP- 半乳糖与该收取细胞做培养;及

太阳城集团d)测量LacCer形成并作为该VEGF途径酶的活性指示。

大部分的例子中上述该试验普遍地将使用已知VEGF反应细胞且将 在适合于试验中维持那些细胞的培养基中培养。例如Eagles’最小基 础培养基(HMEM)或Ham’s F-10培养基。

太阳城集团较佳的VEGF途径抑制剂与活化剂,包含那些存在VEGF途径成员的至 少2-迭至5-迭较大的抑制或活化,它是藉由VEGF途径酶或该途径成 员的基因或蛋白的表达来测量。更较佳的是那些VEGF途径抑制剂与活 化剂存在至少5迭-至10-迭较大的抑制或活化,且甚至更佳的是至少 约10-迭至50-迭较大的抑制或活化。测量表达的方法在实例中叙述。

特别较佳的VEGF途径抑制剂,包含那些有能力特定抑制一个或多 个VEGF途径酶者。换言之,该识别的VEGF途径抑制剂是其些酶相对 差的抑制剂。显然地,该VEGF途径抑制剂应该避免不期望的药物影响, 该影响是可由其他VEGF相关酶的非选择性抑制引起。

太阳城集团本发明的该体内试验对于随后的VEGF途径抑制剂与活化剂在体外 试验表现适当活性的评估是有用的。伴随着侵入性手术,例如球囊血 管修复的再狭窄(restenosis)的兔子模型是较佳的。适合的计画包含 对该兔子投与适合的载剂或与一个或多个目的VEGF途径抑制剂组合的 载剂。该VEGF途径抑制剂的投与量将视各种参数而变化,包括该相关 于目的手术的破坏程度。在例子中当运用球囊血管修复,兔子典型地 将接受候选剂量在(例如i.m.或i.p.)0.5至100之间的VEGF途径抑制 剂,较佳地约1至20之间,且更佳地约该兔子体重的10mg/kg。提供 较佳的VEGF途径抑制剂投药剂量安排在开始实施侵入性手术前24小 时,并接着在该手术后连续投与该VEGF途径抑制剂15天。在其他的 计画,可能在该手术后执行每天该VEGF途径抑制剂注射约2至12周。 该VEGF途径抑制剂的每天注射,例如i.m.或i.p.普遍地是较佳的。 之后,将该兔子安乐死幷摘除血管供测验,较佳地是主动脉。接着以 福马林(formalin)固定该血管幷使用标准组织学程序分析血管内皮细 胞、媒介质及动脉外膜的增殖。

该术语「侵入性手术」意思为涉及对该血管内皮细胞有重大破坏 影响的医学或兽医技术,例如,如心脏、肝脏、肾脏或肢体的器官。 该血管包括该主动脉、冠状动脉、大腿及肠骨动脉与静脉。该侵入性 手术可涉及太阳城集团例如,心脏手术、腹胸手术、动脉手术、器具部署(例 如血管支架或导管)、或动脉内膜切除术。(例示性支架与导管,以及 其使用方法叙述于美国专利申请案公开号第:20050177246、 20050171599、20050171597、20050171598、20050169969、20050165474、 20050163821、20050165352、及20050171593)。较佳的侵入性手术是 血管修复术、尤其是球囊血管修复术。较佳地该侵入性手术是对哺乳 类动物执行,例如灵长类、尤其是人类、啮齿动物或兔子、或饲养的 动物例如猪、狗或猫。

其他VEGF途径抑制剂及活化剂的筛选方法包含:

太阳城集团1)培养人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)及/或缺乏内皮PECAM-1 表达的人类内消旋内皮瘤细胞系[REN-野生型(WT)]及/或 REN(mt-rhPECAM-1)表达人类PECAM-1;

2)将该细胞接触候选VEGF途径抑制剂或活化剂;

太阳城集团3)分析该细胞的LacCer水平及/或该LacCer合成酶、

PECAM-1、PLA2、VEGF或VEGFR的一个或多个的表达。

太阳城集团该LacCer、LacCer合成酶、PECAM-1、PLA2、VEGF或VEGFR的基 因或蛋白表达可能藉由实时(real-time)PCR、PCR、反转录酶PCR、西 方转渍(Western blot)、以及其他所属领域中熟悉该项技术者已知的 方法。

太阳城集团PECAM-1  例示性引物序列如下:分别为(正)5’ TGACCTTCTGCTCTGTT 3’及(逆)5’TGAGAGGTGGTGCTGACATC 3’。β-肌 动蛋白引物可能包含,例如,分别为(正)5’AGGTCATCACTATTGGCAACGA 3’及(逆)5’CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT 3’。

在对象中该VEGF途径抑制剂降低血管新生的治疗能力的确认方 法,包括确认对象血管新生的预治疗水平;将该对象投与治疗有效量 的VEGF途径抑制剂;幷确认该对象血管新生的后治疗水平。在一实施 例,血管新生的减少表明该VEGF途径抑制剂是有效的。该相关实施例 该血管新生的预治疗水平与后治疗水平是在有病组织内确认。

评估该治疗能力或在对象的治疗效果的方法,包括藉由该领域已 知方法确认血管新生的预治疗水平(例如VEGF途径成员的表现水平、 身体诊断、组织的目视检查、在治疗前、当时或之后的不同太阳城集团测量 肿瘤缩小或成长,该测量是以例如双角规形夹(caliper)测量)并且接 着将该对象投与有效量的VEGF途径抑制剂或活化剂。在投与该化合物 的适当一段太阳城集团后(例如在治疗初期之后)例如2小时、4小时、8小时、 12小时或72小时再次确认血管新生水平。该血管新生的调整表明该治 疗的有效。该血管新生的水平可能在整个治疗中周期性地确认。例如, 该血管新生可能每几小时、天、或周就检查以评估该治疗的有效性。 血管新生的减少表明以该抑制剂治疗是有效的。该所述方法可用于筛 选或选择对象,该对像是可能受惠于VEGF途径抑制剂治疗的。

根据本文所述方法,该疾病组织是肺脏、心脏、肝脏、肿瘤、或 脉管系统的一个或多个。该血管新生水平可能藉由PECAM-1表达、 GalT-V表达、管子形成或LacCer水平确认。

如上所述,本发明包含侦测及分析VEGF途径抑制剂及活化剂在治 疗或避免血管新生相关症状治疗能力的方法。该VEGF途径活性可藉由 参考本文之方法测量。

一般而言,该本文揭露的新颖VEGF相关步骤发现VEGF途径活性 对血管新生相关症状的变化。本发明侦测方法是格式化包含一种或多 种的VEGF途径成员。更特别地,该侦测方法包含测量该去调整细胞血 管新生的分子活性的特定步骤。

该VEGF相关步骤是设法得到VEGF细胞反应。VEGF反应细胞可为 永生化细胞系或初代培养细胞(例如由组织或器官所取得)幷表明在一 个或多个特定细胞分子或功能,例如接触适合剂量的VEGF后的血管新 生,的变化。

更具体地,一个策略或或策略的组合可识别VEGF反应的哺乳类细 胞。例如一方法,在适当生长培养基的培养皿种入约1×105个细胞。 对初代培养细胞,由动物取得期望的器官或组织并根据标准方法扩散 (例如声裂法、机械搅动、及/或暴露于该领域已知的分散剂,例如去 垢剂及蛋白酶)。一天或几天后,从该培养皿移除该生长培养基幷以磷 酸盐缓冲盐清洗该细胞。接着将该细胞引入适合的培养基约1至5小 时,且当下加入VEGF去培养。添加该VEGF的剂量将取决于各种参数, 例如被测试的该特定细胞或组织。然而在大部分状况,在每毫升培养 基中约1μg至1mg之间的浓度添加该VEGF去培养,较佳地约1μg至 500μg之间,更佳地约1μg至50μg之间。暴露该细胞于该VEGF后 约1至60分钟之间,较佳地约1至10分钟之间或少于这太阳城集团,移除 该培养基,并将该细胞溶解于适当的裂解缓冲液,例如下列详细叙述。 接着根据本文所述任何方法试验该细胞对添加该VEGF的反应。

尤其较佳的VEGF反应的哺乳类细胞,包含与血管内皮细胞有关的 细胞,例如太阳城集团器官或肢体的血管,尤其是心脏或肾脏细胞。更特别 地,人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)与内皮细胞。

较佳的VEGF途径抑制剂也包含那些在暴露于VEGF后的VEGF相关 途径中表现出良好的调整一个或多个特定分子的能力。尤其于体外侦 测试验中约0.1至100μg/ml之间的浓度,较佳地约1至10μg/ml之 间,较佳的化合物在该分子的活性(相对于适合的控制试验)表现出减 少或增加至少20%、较佳地至少50%,且更佳地至少90%或更高。该分 子的活性在任何各种简易可侦测方法中可减少或增加,该方法包括改 变的合成、降解或贮存;蛋白质修饰,例如磷酸化作用、或藉由带有 特定酶的变构效应(allosteric effect)。

太阳城集团尤其,若该目的分子是酶,较佳地VEGF途径抑制剂包含那些在下 述酶试验中表现出良好活性者。较佳地,在该试验中IC50是约20μM或 较低,更佳地IC50是约1μM或较低。

太阳城集团一般用于特定试验的控制实验是量身订制的。例如,大部分的控 制实验,是太阳城集团使测试样品(例如VEGF反应的细胞或其裂解液)遭受 培养基、盐类、缓冲液或水而非可能的VEGF途经抑制剂,且该细胞同 样接受测试化合物的剂量。接着将期望的试验根据本方法执行。适合 的控制实验的特定例子在下文中叙述。

太阳城集团该呈现的侦测方法也可被用于识别由生物资源取得的VEGF途径抑 制剂或活化剂,包括调整VEGF途径活性的特定生长因子、细胞因子 (cytokines)及脂蛋白。

该呈现的侦测方法进一步包含测量在VEGF相关生化步骤的特定分 子活性的试验。该测量可藉由标准实验室操作例如化学发光测试、薄 层层析(TLC)分离、核酸分离与纯化、SDS-PAGE胶电泳、自动射线照相 术、闪烁记数、密度法、北方及西方转渍杂交技术、及免疫试验(例如 RIA及ELISA测试)实施。普遍地,参照Sambrook et al.in Molecular Cloning:A Labora tory Manual(2d ed.1989);及Ausubel et al. (1989),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons, New York讨论相关许多该标准方法,该揭露幷入本文以兹参考。

在一态样,该呈现的体外试验测量VEGF反应的细胞中该特定酶的 活性。发现随着细胞暴露于VEGF及/或特定VEGF途径抑制剂,例如PDMP 或其他以下所述者,该酶的活性被调整。

太阳城集团提供额外的体外试验,该试验是测量一个或多个酶,该酶是已发 现藉由本文所述的VEGF途径抑制剂所调整。

例如,核苷限苷三磷酸、尤其是环状核苷限苷三磷酸,例如胍核 苷限苷三磷酸(GTP)藉由该ras-GTP-结合蛋白与致癌基因蛋白合幷,例 如ras蛋白(例如负载ras-GTP),幷藉由一些确定的方法包括核苷限苷 三磷酸(例如GTP)合幷Ras的直接侦测。例如,在一方法中,VEGF反应 的细胞是以放射性正磷酸盐(例如32P-标记)对细胞内该可侦测标记 (detectably-label)的GTP做代谢性标记。该标记的细胞藉由VEGF途径 抑制剂以LacCer培养,且接着清洗幷溶解于适合的裂解缓冲液,例如 RIPA(参照下述)。之后,该细胞裂解液在适合的TLC片上分离。该TLC 片是暴露于X射线薄膜并接着实施密度法,若需要的话,去估计该GTP 与该Ras蛋白的合幷。侦测负载ras-GTP的较佳方法揭露于Chatterjee, S.et al.,(1997)Glycobiology,7:703。

同样地也提供测量该VEGF途径酶的方法。例如,在一方法,该VEGF 反应的细胞是以VEGF及可能的VEGF途径抑制剂培养,清洗幷接着, 暴露于该VEGF后的1至60分钟后收取、较佳地1至10分钟或少于。 制备整个细胞裂解液并接着实施SDS-PAGE胶电泳。该胶被转移至适合 的薄膜支撑物幷接着用西方转渍(Western blot)杂交程序以抗体直接 探测该VEGF途径成员。

额外的在体外适合测量藉由VEGF及VEGF途径抑制剂调整,包括 监视细胞增殖因子的表达。对该分析较佳的细胞增殖因子是增殖细胞 核抗原(PCNA)。在一适合的方法,该培养的细胞是在伴随VEGF途径抑 制剂之后以VEGF培养,接着以适合的缓冲液清洗。可藉由使用有能力 明确地结合该PCNA的单克隆抗体(例如PC10抗体)侦测(若想要的话还 可估计)在培养的细胞中的PCNA。参考Sasaki,K.,et al.(1993) Cytometry 14:876-882。该PCNA接着在细胞中可藉由各种免疫学方法, 包含流式细胞术(flow cytometry)或固定的细胞部位免疫组织化学显 像法(immunohistochemical visualization)。

血管内皮生长因子(VEGF)已被暗示血管新生涉及冠状动脉心脏 病、糖尿病血管幷发症、发炎血管疾病与肿瘤转移。虽然,VEGF驱使 太阳城集团鞘糖脂,例如乳糖基神经酰胺的血管新生的机制是未知的。为证 明在VEGF太阳城集团LacCer诱导血管新生,我们使用在HUVECs中合成LacCer 表达(GalT-V/VI)的siRNA媒介沉默。这基因沉默显著地抑制VEGF诱导 的PECAM-1表达与血管新生。再来,我们使用D-苏-1-苯基-2-癸酰氨基 -3-吗啉基-1-丙醇(D-PDMP),LacCer合成酶的抑制剂与葡糖神经酰胺 (glucosylceramide)合成酶,并显著地缓和VEGF诱导的PECAM-1表达与 血管新生。有趣地,这些表现型变化是藉由LacCer反转,但不是藉由 结构相关化合物例如葡糖神经酰胺、双半乳二糖苷神经酰胺及神经酰 胺。在缺乏PECAM-1的该内生表达的人类内皮细胞系(REN), VEGF/LacCer无法刺激PECAM-1表达及管子形成/血管新生。虽然在 siRNA细胞表达人类PECAM-1基因/蛋白,VEGF与LacCer二者诱导 PECAM-1表达及管子形成/血管新生。实际上,是藉由SU-1498,VEGF 受体酪氨酸激酶抑制剂缓和VEGF诱导的血管新生而非LacCer诱导的血 管新生。同样地,藉由蛋白激酶C(PKC)与磷脂酶A2(PLA2)抑制剂缓和 VEGF/LacCer诱导的PECAM-1表达与血管新生。此外,藉由1-吡咯烷二 硫代羧酸(PDTC)、NF-kB抑制剂、二亚苯基碘(DPI)NADPH氧化酶抑制 剂与N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抗氧化剂缓和VEGF/LacCer诱导的 PECAM-1表达与血管新生。这些结果表明在VEGF治疗的内皮细胞产生的 LacCer可能对于PECAM-1表达与在血管新生是作为重要的信号分子。这 发现以及在我们的报告中发展的试剂,可能在体外及体内进一步研究 中对于抗血管新生药物是有效的。

抗体

太阳城集团在本文所述方法中有效的抗体是明确针对VEGF途径成员的抗体, 包括VEGF、VEGFR、LacCer合成酶、LacCer、PECAM-1、及PLA2。特别 佳的抗体是那些抑制VEGF途径成员活性的抗体。以下更完整的叙述产 生在本文所述方法中有效抗体的方法。

例示性的抗体包含LacCer合成酶(GalT-V/VI)抗体,特定地缓和 VEGF诱导的体外血管新生/管子形成。其他用于本文所述方法的例示性 抗体是特定针对GalT-V肽序列的抗体,包括 IGAQVYEQVLRSAYAKRNSSVND及IGMHMI-----RLYTNKNSTLNGT。更多本文 所述方法中有效的抗体是特定针对下列LacCer合成梅(GalT-V/VI)序 列:

太阳城集团人类合成GalT-V肽:

太阳城集团(115)PERLP(119)

太阳城集团(145)PTIKLGGHWKP(155)

(160)PRWKVAILIP(169)

(196)PFRNRHEHLP(178)

(178)PVLFRHLLP(186)

(316)PEGDTGKYKSIP(328)

人类GalT-VI肽

太阳城集团(97)PENFTYSP(104)

(104)PYLP(107)

太阳城集团(107)PCPEKLP(113)

(143)PGGHWRP(149)

(154)PRWKVAVLIP(163)

(163)PFRNRHEHLP(172)

(172)PIFFLHLIP(180)

(311)PEGDLGKYKSIP(322)

太阳城集团(374)PELAP(378)

嵌合与人源化单克隆抗体,包含人类与非人类部分二者的抗体是 可藉由标准重组DNA技术制造。该嵌合与人源化单克隆抗体可藉由该 领域习知重组DNA技术制备,例如使用Robinson et al.等人在国际申 请案PCT/US86/02269所述的方法;Akira,et al.欧洲专利申请案第 184187号;Taniguchi,M.,欧洲专利申请案第171496号;Morrison et al.欧洲专利申请案第173494号;Neubergeret et al.PCT国际公开 号WO86/01533;Cabilly et al.美国专利第4816567号;Cabilly et al. 欧洲专利申请案第125023号;Better et al.(1988)Science 240:1041-1043;Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 3439-3443;Liu et al.(1987)J.Immuno.139:3521-3526;Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218;Nishimura et al.(1987)Canc.Res.47:999-1005;Wood et al.(1985)Nature 314: 446-449;及Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst. 80:1553-1559);Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202-1207; Oi et al.(1986)Bio Techniques 4:214;Winter美国专利第5225539 号;Jones et al.(1986)Nature 321:552-525;Verhoeyan et al.(1988) Science 239:1534;及Beidler et al.(1988)J.Immunol. 141:4053-4060。

全人类抗体尤其是供人类患者期望的治疗。该抗体可使用转基因 鼠制造,该鼠是有能力表达内源免疫球蛋白重和轻链基因,但该抗体 是可表达人类重和轻链基因。参照,例如Lonberg and Huszar(1995) Int.Rev.Immuno.13:65-93);及美国专利第5625126、5633425、 5569825、5661016、及5545806号。此外,例如Abgenix,Inc.公司 (Fremont,Calif.)与Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)从事于提供 使用类似于上述技术直接对抗选择抗原的人类抗体。

可使用太阳城集团「指导选择」的技术产生识别选择的抗原决定区的全 人类抗体。在这方法中,选择的非人类单克隆抗体,例如鼠类抗体, 被用作指导识别相同抗原决定区的全人类抗体的选择。这技术描述于 Jespers et al.(1994)Bio/Technology 12:899-903)。

本文中使用的该术语「单克隆抗体」表明由本质上同源的抗体群 取得的抗体,例如除了可能存在于该抗体细胞的小亚群中的可能自然 发生突变,该群中的个别抗体是相同的。本文中该单克隆抗体明确地 包含「嵌合」抗体,其中该重及/或轻链的部分是与衍生自特定种类或 属于特定抗体型或亚型的抗体中对应序列是相同的或同源的,而该链 其余部分是与衍生自其他种类或属于其他抗体型或亚型的抗体中对应 序列是相同的或同源的,该抗体的片段也是一样,只要他们表现出期 望的拮抗(antagonistic)活性。(参考美国专利第4816567;及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

该呈现的单克隆抗体可使用任何制造单克隆抗体的程序制造,例 如,本发明的单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备,例如Kohler与 Mildtein在Nature,256:495(1975)叙述的方法。在杂交瘤方法中, 小鼠或其他适合的宿主动物典型地被免疫试剂免疫化以引起制造抗体 的淋巴球将特定地结合该免疫试剂。

该单克隆抗体同样地可藉由重组DNA方法制造,例如美国专利第 4816567(Cabilly et al.)。DNA编码所示单克隆抗体可轻易的分离幷 使用传统程序序列化(例如藉由使用可特定结合该编码抗体的重与轻 链基因的寡核苷酸探针)。抗体或活性抗体片段库也可使用噬菌体呈现 技术基因技术(phage display techniques)产生,例如描述于Burton et al.的美国专利第5804440号与Barbas et al.的美国专利第6096551 号。

太阳城集团体外方法也适合于制备单价抗体。抗体的消化去制造其片段,尤 其,Fab片段,可使用该领域惯用的技术达成。例如,可使用木瓜蛋白 酶实施消化。木瓜蛋白酶消化的例子描述在国际专利申请公开号第 W094/29348,公开于1994年12月22日,以及美国专利第4342566号。 抗体的木瓜蛋白酶消化典型地制造两个相同抗原结合片段,称为Fab 片段,每个带有单一抗原结合部位以及Fc片段残基。胃液素治疗产生 具有两个组合部位且仍有能力交互内衬(cross-lining)抗原。

本文中使用该术语「抗体或其片段」包含带有双或多个抗原或抗 原决定区特性的嵌合抗体与杂交抗体、单链抗体与片段,例如 F(ab’)2、Fab’、Fab、scFv及其类似物,包括杂交片段。因此,提 供了保持结合它们特定抗原的能力的该抗体片段。例如,维持HIV gp120结合活性的抗体片段被包含在该术语「抗体或其片段」的意义里。 该抗体及片段可藉由习知技术制造,并可根据在实例以及在供专一性 与活性抗体筛选与制造的一般方法做专一性与活性筛选。(参考 Harlow and Lane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York(1988))。也包含于该「抗体或其片 段」的意思,是所述的抗体片段与抗原结合蛋白(单链抗体)的共轭物, 例如在美国专利第4704692号,其内容幷入本文以资参考。

该片段,不论是否粘附其他序列与否,可同样地包含特定区或特 定氨基酸残机的插入、删除、取代或其他选择的修饰,其提供该抗体 或该抗体片段的活性相较于未修饰的抗体或抗体片段不会有显著的变 化或受损。这些修饰可提供额外的性质,例如移除/添加氨基酸二硫结 合能力,增加生物寿命、改变分泌特征;等等。在任一例子中,该抗 体或抗体片段必定占有生物活性性质,例如特定结合关联(cognate)抗 原。该抗体或抗体片段的功能或活性区可藉由该蛋白特定区的突变形 成识别,接着藉由该表达的多肽表达与测试。该方法对该领域从事该 技术者是轻易地显而易见且该方法可包含该核酸编码的该抗体或抗体 片段的部位特定(site-specific)突变形成(Zoller,M.J.Curr.Opin. Biotechnol.3:348-354(1992))。

太阳城集团本文中使用的该术语「抗体」或「抗体们」也可表明人类抗体及/ 或人源化抗体。许多非人类抗体(例如那些衍生自小鼠、大鼠或兔子者) 在人体内是自然抗原性的,且因此当投与人类时可引起不期望的免疫 反应。于是,本发明中人类或人源化抗体的使用提供教示抗体投与人 类将引起不期望的免疫反应的变化。

人类抗体也可使用其他技术制备。人类单克隆抗体制造技术的例 子包含那些Cole et al.所述的(Monoclonal Antibodies and Therapy, Alan R.Liss,p.77(1985))以及Boerner et al.(J.Immunol. 147(1):86-95(1991))。人类抗体(及其片段)也可使用噬菌体呈现技术 基因库制造(Hoogenboom et al.,K.Mol.Biol.227:381(1991); Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。

太阳城集团人类抗体也可由转基因动物取得。例如,转基因,突变的小鼠可 制造人类抗体全谱以反应免疫化,已描述于(参考例如,Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:2551-255(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);及Bruggermann et al.,Year in Immunol.7:33(1993))。明确地,在这些嵌合与种系(germ-line)突变 小鼠中的该抗体重链连接区(J(H)基因的纯合子(homozygous)侦测导 致内源抗体制造的完全抑制,而且该人类种系抗体基因阵列的成功转 移进入该种系突变小鼠导致根据抗原攻击的人类抗体制造。

太阳城集团抗体人源化技术一般是太阳城集团使用重组DNA技术处理该DNA序列编 码抗体分子的一个或多个多肽链,因此,非人类抗体(或其片段)的人 源化形式是嵌合抗体或抗体链(或其片段,例如Fv、Fab、Fab’、或其 他抗体的抗原结合部分),其是包含由非人类(供体)抗体的抗原结合部 位的部分整合进入人类(受体)抗体的骨架。

为产生人源化抗体,已知藉由一个或多个供体(非人类)抗体分子 的CDRs取代一个或多个受体(人类)抗体的互补决定区(CDRs)的残基, 是去获得期望的抗原结合特征(例如该标靶抗原特异性与亲合力的特 定水平)。在一些例子中,人类抗体的Fv骨架(FR)残基是藉由对应的 非人类残基取代。人源化抗体可能包含既不是发现于受体抗体也不是 在输入性CDR或骨架序列的残基。概括而言,人源化抗体具有一个或 多个由非人类来源诱导进入的氨基酸残基。实际上,人源化抗体是典 型地人类抗体,其中一些CDR残基与可能的一些FR残基被来自啮齿动 物抗体类似部位所取代。人源化抗体普遍地包含至少抗体恒定区(Fc) 的部分,典型地是人类抗体的那部分(Jones et al.,Nature 321:522-525(1986));Reichmann et al.,Nature 332:323-327 (1988);及Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992))。

非人类抗体的人源化方法是该领域已知的。例如,人源化抗体可 根据Winter与其同事的方法产生(Jones et al.,Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988);及Verhoeyen et al.,Science 239:1534536(1988)),藉由啮齿动物CDRs或CDR 序列取代该人类抗体的对应序列。可用于制造人源化抗体的方法也描 述于美国专利第4816567号(Cabilly et al.)、美国专利第5565332 号(Hoogenboom et al.)、美国专利第5721367号(Kay et al.)、美国 专利第5837243号(Deo et al.)、美国专利第5939598号(Kucherlapati et al.)、美国专利第6130364号(Jakobovits et al.)、及美国专利 第6180377号(Morgan et al.)。

医药组合物与套组

本文描述的该小分子、肽、核酸、及抗体疗法可能配成医药组合 物幷以套组提供。该医药配方可能也涂布医学装置或奈米颗粒以作为 传递之用。

太阳城集团该词语「医药上可接受载体」是领域中认可幷包含适合对哺乳动 物投与本发明化合物的医药上可接受材料、成分或载剂。该载体包括 液体或固体填料、稀释液、赋形剂、溶剂或封入胶囊的材料,其是关 于携带或传送对象试剂由一器官、或身体的部分到其他器官或身体的 部分。每一载体必须是与其他配方成分相容的意思上是「可接受的」 并且对患者无害。一些作为医药上可接受载体的例子,包括糖、例如 乳糖、葡萄糖及蔗糖;淀粉,例如玉米淀粉与马铃薯淀粉;纤维素、 及其衍生物,例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、纤维素乙酸盐、粉 末状黄耆胶、麦芽、明胶、滑石;赋形剂,例如可可粉奶油与栓剂蜡; 油,例如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油与大豆 油;乙二醇,例如丙二醇;多元醇,例如丙三醇、山梨醇;甘露糖醇、 聚乙二醇;酯,例如油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂;缓冲剂,例如氢 氧化镁与氢氧化铝;海藻酸;无热源(pyrogen-free)水;等渗压盐; Ringer’s溶液;乙醇、磷酸盐缓冲液;及其他用于医药配方的无毒相 容性物质。

湿润剂、乳化剂与润滑剂,例如硫酸月桂酯钠与硬脂酸镁,还也 着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂、香料、防腐剂与抗氧化 剂也可用于该组合物。

医药上可接受抗氧化剂的例子,包括:水溶性抗氧化剂,例如抗 坏血酸、半胱胺酸氯化氢、二硫酸钠、偏重亚硫酸钠、亚硫酸钠及其 类似物;油可溶性抗氧化剂,例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴 香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、五倍子酸丙酯、α-生育 酚、及其类似物;金属螯合剂、例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 山梨醇、酒石酸、磷酸及其类似物。

本发明的配方,包括那些适合口服、鼻、局部、皮肤、口颊、舌 下、肌内、腹膜内、直肠、阴道及/或非口服的投与。该配方可能方便 以单位剂量形式呈现并以任何药物领域已知方法制备。可与载体材料 组合以制造单一剂量的该活性成分剂量形式将普遍地是产生疗效的化 合物剂量。概括而言,在一百分比里,这剂量将由活性成份的约1百 分比至约99百分比范围,较佳地约5百分比至约70百分比,最佳地 约10百分比至约30百分比。

制备这些配方或组合物的方法,包括使本发明的抗体或错合剂与 该载体及,视情况地,一个或多个附加成分结合的步骤。一般而言, 该配方是藉由均匀地、详尽地使本发明化合物与液体载体或细微地分 开的固体载体结合、或一起、及接着若需要的话成形该产物。

太阳城集团适合口服投药的本发明配方可能的形式为扁囊剂、胶囊、锭剂、 片剂、菱形锭剂(使用调味成份、通常是蔗糖与阿拉伯胶或黄耆胶)、 粉剂、粒剂、或溶液或水溶液中或非水溶液中悬浮液、或水包油或油 包水液态乳液、或酏剂或糖浆或喉糖(使用惰性碱、例如明胶与丙三醇 或蔗糖与阿拉伯胶)及/或嘴洗剂及该类似物,每一种作为活性成份包 含预先确定的本发明化合物剂量。本发明的化合物可能也以大丸药、 糖剂或糊剂投与。

本发明供口服投药的固体剂量形式(胶囊剂、锭剂、片剂、糖衣药 丸、粉剂、粒剂、及其类似物),该活性成分是与一个或多个医药上可 接受载体混合,例如柠檬酸钠或二钙磷酸盐、及/或下列任一种:填料 或补充剂,例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、硅酸;粘合 剂,例如羧甲基纤维素、海藻胶、明胶、聚乙烯基吡咯啶酮、蔗糖及/ 或阿拉伯胶;湿润剂列如甘油;崩解剂,例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马 铃薯或树薯淀粉、海藻酸、特定硅酸盐、碳酸钠;溶液延迟剂,例如 石蜡;吸收加速剂,例如四及铵盐化合物;湿润剂,例如十六醇与甘 油单硬脂酸酯;吸收剂,例如高岭土及膨润土;润滑剂,例如滑石、 硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸纳、及其混合物;及 着色剂。在胶囊、锭剂、片剂及糖衣药丸的例子中,该医药组合物可 能也包括缓冲剂。类似形式的固体组合物可能被用作软及硬填充明胶 胶囊的填料,及使用该赋形剂如乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇 及其类似物。

太阳城集团片剂可能藉由压缩或压模性制造,幷视情况地带有一个或多个添 加成分。压缩的片剂可能使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、 润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羧基乙酸淀粉钠或交联的 羧甲基纤维素钠)、表面活性或分散剂制备。压模成形片剂可能藉由适 合的机器将与惰性液体稀释剂湿润的该粉末化合物压模成形。

太阳城集团该片剂、及其他本发明医药组合物的固体剂量形式,例如糖衣药 丸、胶囊、锭剂与粒剂可能视情况地与涂布剂与壳体制备或制成,例 如肠内涂布剂与其他在医药配方领域中已知的涂布剂。它们也可能被 配方成提供该活性成分的缓慢或控制释放,例如其中使用各种比例的 羟丙基甲基纤维素钠以提供期望的释放方式、其他高分子基质、脂质 体及/或微球。它们可能藉由例如,经由细菌自留(bacteria-retaining) 滤器过滤消毒、或藉由合幷可溶于无菌水的无菌固体组合物形式的杀 菌剂消毒,或紧接着使用前一些其他无菌可注射媒介物。这些组合物 可能也视情况地包含乳浊(opacifying)剂及可能是它们仅仅或优先地 在该胃肠道的特定部位释放该活性成分组合物的,视情况地,以延迟 方式。可使用的嵌入(embedding)组合物的例子包括高分子物质及蜡。 该活性成分也可是微封入胶囊形式,若适合的话还带有一个或多个上 述的赋形剂。

供口服投与本发明化合物的液体剂量型,包括医药上可接受乳化 剂乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液糖浆与酏剂。该活性成分外,该液体 剂量型可能包含该领域中普遍使用的惰性稀释剂,例如水或其他溶剂、 增溶剂与乳化剂,例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙基醋酸盐、苯甲 醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其棉籽、花生、玉米、 胚芽、橄榄、蓖麻及芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇、与山 梨醇脂肪酸酯、及其混合物。

除了惰性稀释剂外,该口服组合物也可包含佐剂、例如湿润剂、 乳化剂及悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香料剂与防腐剂。

太阳城集团悬浮液,除了该活性化合物,可能包含悬浮剂,例如氧乙基异十 八醇、聚氧乙烯山梨醇、与山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、 膨润土、琼脂-琼脂与黄蓍胶、及其混合物。

太阳城集团供直肠或阴道投药的本发明该医药组合物的配方可能以栓剂呈 现,其可剂藉由混合一个或多个本发明化合物以及一个或多个适合的 不刺激赋形剂或载体制备,该赋形剂或载体包括可可粉奶油、聚乙二 醇、栓蜡、或水杨酸盐,其在室温下为固体,但在体温时则为液体, 并且因此会融化于直肠或阴道内并释放该活性化合物。

太阳城集团本发明适合阴道投药的配方,也包括阴道药栓、棉栓、乳霜、胶 体、糊剂、泡沫或喷雾剂配方,其包含该领域已知适当的载体。

供局部或透皮投与本发明化合物的剂量型,包括粉剂、喷雾剂、 软膏、糊剂、乳霜、洗剂、胶体、溶液、贴片、与吸入剂。该活性化 合物可能在无菌条件下与医药上可接受载体混合,以及与任何可能需 要的防腐剂、缓冲液或推进剂。

该软膏、糊剂、乳霜及胶体可能包含,除了本发明活性化合物外, 还有赋形剂,例如动物与植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、 纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石及氧化锌、 或其混合物。

太阳城集团除了本发明活性化合物外,粉剂与喷雾剂可包含赋形剂,例如乳 糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙及聚酰胺粉末、或这些物质的混 合物。喷雾剂可额外地包含惯用的推进剂,例如氯氟碳氢化物与挥发 性未取代碳氢化物,例如丁烷与丙烷。

皮肤贴片具有提供本发明化合物控制传递至身体的额外优点。该 剂量型可藉由将该化合物溶解或分散于适当媒介物中制造。提升吸收 剂亦可用于增加该化合物进入皮肤的量。可藉由提供速率控制薄膜或 在高分子基质或胶体中分散该活性化合物控制该流量速率。

眼药配方,眼用软膏、粉剂、溶液及其类似物亦可考虑包含于本 发明范围。

太阳城集团适合于非经肠胃投药的本发明医药组合物,包括一种或多种的本 发明化合物与一种或多种的医药上可接受无菌等渗压水性或非水性溶 液、分散液、悬浮液或乳化液、或无菌粉末的组合,其可能在使用前 再组成无菌的可注射溶液或分散液,并可能包含抗氧化剂、缓冲液、 抑菌剂、使配方与受体的血液或悬浮或稠化剂等渗压的溶解物。

可能用于本发明医药组合物的适合的水溶性与非水溶性载体的例 子,包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、及其类似 物)、及其适合的混合物、蔬菜油、例如橄榄油、及可注射的有机酯, 例如油酸乙酯。可藉由,例如使用涂布材料,例如卵磷脂、藉由分散 液中维持该所需颗粒尺寸,及藉由使用界面活性剂维持适当的流动性。

太阳城集团这些组合物可能也包含佐剂,例如防腐剂、湿润剂、乳化剂及分 散剂。微生物作用的避免可能藉由包含抗菌剂及杀真菌剂作确保,例 如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸、及其类似物。也可能期望包含 等渗压剂,例如糖、氯化钠、及其类似物在该组合物中。此外,该可 注射医药形式的吸收延长可能藉由包含延迟吸收剂达成,例如单硬脂 酸铝与明胶。

在一些例子中,为了延长药物的效果,则期望去缓慢由皮下或肌 肉内注射的药物吸收。这可藉由使用不良水溶性的晶形或非结晶形材 料液体悬浮液达成。那么该药物的吸收速率就取决于溶解速率,依次, 可能取决于晶体尺寸与结晶形式。另一选择,非经肠胃投与药物的延 迟吸收可藉由在油载剂中溶解或悬浮该药物而达成。

注射储库形式是由生物可降解高分子形成该主题化合物的微胶囊 基质制造,例如聚乳酸-聚甘醇酸。视药物对高分子的比率,以及所用 的该特定高分子性质,可控制该药物释放的速率。其他生物可降解高 分子的例子包括聚原酸酯(poly(orthoesters))与聚酸酐 (poly(anhydride))。储库注射配方也藉由将药物置入相容于身体组织 的脂质体或微乳液中制备。

太阳城集团本发明可能藉由口服、非经肠胃、局部、或直肠地给予制备。当 然是藉由适合投药路径形式给予。例如,藉由注射、吸入、眼洗液、 软膏、栓剂等等以片剂或胶囊形式投与;藉由注射、灌入或吸入投与; 局部的藉由洗液或软膏;及藉由栓剂直肠投与。较佳的是口服投药。

太阳城集团本文中使用的该词语「非经肠胃投药」及「非经肠胃地投与」意 思为除了肠道与局部投药模式外,通常藉由注射、还包括但不限于, 静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮肤内、腹 膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内及 胸骨内注射与灌入。

本文中使用的该词语「系统性投药」、「系统地投与」、「周围的投 药」意思是化合物、药物或其他材料的投与,除了以直接进入中枢神 经系统外,该进入患者体系统也因此进行新陈代谢及其他类似过程, 例如,皮下投药。

太阳城集团藉由任何适合的投药路径,可能投与人类及其他动物供治疗的该化 合物,包括口、鼻、如藉由,例如喷雾、直肠、阴道内、肠胃外、脑 池内、与局部地,如藉由粉剂、软膏、或滴液,包括口颊地与舌下地。

不论该选择投药的路径,可能以水合物形式使用的本发明的化合物 及/或本发明的医药组合物,是藉由熟悉该项技术者习知的传统方法配 方成医药上可接受剂量形式。

本发明医药组合物的该活性成份的实际剂量水平可能有变化,以便 于得到对特定患者有效达到该期望治疗反应的该活性成分剂量、组合 物及投药模式,而且是对患者没有毒性的。

该选择的剂量水平将取决于各种因素,包括所使用的本发明特定化 合物的活性,或该酯类、盐类或其氨类、该投药路径、该投药太阳城集团、 被使用的特定化合物的该排泄速率、该治疗的期间、与该使用特定化 合物组合的其他药物、化合物及/或材料、该年龄、性别、体重、状况、 一般健康状态与该被治疗患者以往病历、及医疗领域已知的类似因素。

太阳城集团该领域具有熟悉技术的医师或兽医可轻易地确认与预测所需医药 组合物的有效量。例如,该医师或兽医可一开始使用低于所需达成该 期望治疗效果的本发明医药组合物的化合物剂量水平,并逐渐增加该 剂量直到达成该期望效果。

一般而言,适合的本发明化合物每天剂量,将是有效产生治疗效果 的化合物最低剂量。该有效剂量普遍地将取决于上述因素。概括而言, 当使用于该指示的止痛效果,给予患者本发明化合物的静脉内与皮下 剂量,将由每天体重的每公斤约0.0001至约100毫克,较佳地由每天 每公斤约0.01至约50毫克,且更佳地约由每天每公斤约1.0至约100 毫克。有效量是指治疗血管新生或相关疾病的量。

太阳城集团如果期望的话,该活性化合物的有效每日剂量可能投与以一剂量或 二、三、四、五、六或更多次剂量,在一整天适当间隔分次地投药, 视情况地,以单位剂量形式。

太阳城集团当可能以单独投与本发明化合物时,较佳地是以医药组合物投与该 化合物。此外,本文所述的该医药组合物可能与一种或多种活性成分 投与,其有助于治疗具有HIV感染的对象。相关实施例中,本发明该 医药组合物可能被配成包含一种或多种额外的活性成分,其有助于治 疗具有HIV感染或相关疾病或症状的对象。

太阳城集团如上述制造的该抗体与错合物,可以套组与适当的说明以及其他需 要的试剂提供,以执行上述免疫试验。取决于特定使用的免疫试验, 该套组也可包含适合的标记与其他包装的试剂及材料(例如清洗缓冲 液及其类似物)。标准的免疫试验,例如上述的试验,可使用这些套组 执行。该医药组合物可被包含于容器、包装物、套组或分配器连同说 明一起,例如投药的文字说明,尤其是使用该抗体或错合物去治疗或 避免血管新生或相关疾病的说明。该容器、包装物、套组或分配器也 可能包含,例如有助于治疗具有异常血管新生的对象的一种或多种的 活性成分。

供标靶LacCer合成酶mRNA的RNAi组合物

太阳城集团VEGF途径抑制剂也包括,例如PECAM-1、LacCer、LacCer合成酶、 或PLA2 siRNA分子。例如,5’-CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3’(正 义)、5,UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3’(反义)。RNAi分子可能 干扰任一个VEGF途径成员的mRNA部分。

太阳城集团本文中使用的该术语「RNA干扰」(RNAi)表明RNA的选择性细胞内 降解。RNAi在细胞中自然地发生以移除外来的RNAs(例如病毒RNAs)。 自然的RNAi于经由从无daRNA分离的片段开始,命令其他相似RNA序 列该降解机制。可选择地,RNAi可藉由人类技术起始,例如,沉默该 标靶基因表达。有用于RNAi的RNAi分子有时在本文是表明微小干扰 的RNAs(siRNA)。

太阳城集团藉由「降低或抑制」是表明相较于没有使用反义核苷酸寡聚物或用 于RNA干扰的dsRNA治疗的样品,在蛋白或核酸水平造成整体降地较 佳地20%或更高,更佳地50%或更高,及最佳地75%或更高,这是藉由 前述试验所侦测的(参照「表达」)。

具有「足以互补标靶mRNA序列的序列以命令专一标靶 (target-specific)的RNA干扰(RNAi)」的siRNA意思是该ss-siRNA 具有序列,是足以藉由该RNAi装置或程序触发该标靶mRNA的消灭。

太阳城集团本发明各种的方法,包括的步骤,太阳城集团比较「适合的控制」(在本 文可替换地表明为「适当的控制」)的数值、水平、特性、特征、性质 等等。「适合的控制」或「适当的控制」是任何类似于有用于比较目的 的一种习知技术的控制或标准。在一实施例,「适合的控制」或「适当 的控制」是决定于实施本文所述的RNAi方法前数值、水平、特性、特 征、性质等等。例如,转录速率、mRNA水平、转译速率、蛋白质水平、 生物活性、细胞特征或性质、基因型、表现型等等可于执行本发明的 siRNA进入细胞或有机体前决定。在另一实施例,「适合的控制」或「适 当的控制」是决定于细胞或有机体内的数值、水平、特性、特征、性 质等等,例如展现如正常特征的控制或正常细胞或有机体。再于另一 实施例,「适合的控制」或「适当的控制」是指预设的数值、水平、特 性、特征、性质等等。

具有「足以互补标靶mRNA序列的序列以命令专一标靶 (target-specific)的RNA干扰(RNAi)」的RNA链意思是该链具有序列, 是足以藉由该RNAi装置或程序触发该标靶mRNA的消灭。

太阳城集团藉由「微小干扰RNAs(siRNAs)」(在该技术领域中也表明为「短干 扰RNAs 」)的意思是具有约10至50个核苷酸(或核苷酸类似物)的分离 的RNA分子,其有能力命令或媒介RNA干扰。该siRNA较佳地是大于 10个核苷酸长度,更佳地是大于15个核苷酸长度,且最佳地是大于 19个核苷酸长度,以用于去识别被降解的标靶基因或mRNA。19至25 个核苷酸的范围是siRNA最佳的尺寸。siRNA也可包括短发夹RNA,其 中siRNA双螺旋链二者是包含在单一RNA分子中。siRNA包括dsRNA 的任何形式(特别地是较大dsRNA的分离产物、部分纯化的RNA、实质 上纯的RNA、合成的RNA、重组制造的RNA)以及藉由添加、消除、取代、 及/或一个或多个核苷酸的改变且不同于自然发生RNA的改变RNA。该 改变可包括非核苷酸材料的添加到,例如该21至23个nt RNA终端或 内部(在该RNA的一个或多个核苷酸)。在较佳实施例,该RNA分子包 含3’羟基。本发明RNA分子中的核苷酸也可包括非标准核苷酸,包括 非自然发生核苷酸或脱氧核糖核苷酸。总体而言,所有该改变的RNA 是指RNA的类似物。本发明的siRNA仅需要足以类似自然的RNA去具 有调控RNA干扰(RNAi)的能力。本发明的RNAi试剂也可包括小发夹 RNAs(shRNAs),且表达建构去操控表达shRNAs。ShRNAs的转录是在聚 合酶III(pol III)启动子启始的,而且被认为是在4-5-胸苷转录终端部 位的2号位置结束。基于表达,shRNAs被认为折叠成带有3’UU-悬端 的茎环(stem-loop)结构;接着,这些shRNAs该终端被处理,转变该 shRNAs成为约21至23个核苷酸的类似siRNA分子。(Brummelkamp et al.,Science 296:550-553(2002);Lee et al,(2002).supra; Miyagishi and Taira,Nature Biotechnol.20:497-500(2002); Paddison et al.(2002),supra;Paul(2002),supra;Sui(2002) supra;Yu et al.(2002),supra)。

太阳城集团SiRNAs也包括「单链微小干扰RNA分子」。「单链微小干扰RNA分子」 (「ss-siRNA分子」或「ss-siRNA」)。ss-siRNA是活性单链siRNA分 子,它以基因特定方式沉默该对应基因标靶。较佳地,该ss-siRNA分 子具有约10至50个或更多核苷酸的长度。更佳地,该ss-siRNA分子 具有约19至23个或更多核苷酸的长度。除了组合物包括ss-siRNA分 子,本发明其他实施例包括制造该ss-siRNA分子的方法以及供使用该 ss-siRNA分子的方法(例如研究及/或治疗方法)。

本文中使用该术语「特定地杂交」或「特定地侦测」表明核酸分子 去杂交样品核酸的至少约6个连续核苷酸的能力。

太阳城集团「标靶基因」是被选择性抑制或「沉默」表达的基因,例如VEGF 途径。这沉默是藉由siRNA及藉由分离该标靶基因的mRNA,它是藉由 细胞的RNAi系统从RNA工程前体产生。该RNA前体的双螺旋茎部分或 片段是互补(例如全互补的)于该标靶基因mRNA的约18至40个或更多 核苷酸反义链。

本发明普遍的是太阳城集团藉由使用该VEGF途径成员的基因及其产物抑 制它们的表达来治疗或处理血管新生。本发明的实施例是太阳城集团包括将 该细胞接触化合物的方法,该化合物抑制一个或多个VEGF、VEGFR、 LacCer合成酶、PECAM-1基因的合成或表达,并使用足以造成该抑制 作用的剂量。不拘泥于理论,该抑制作用是藉由选择性标靶VEGF途径 成员的DNA或mRNA(例如妨碍该基因的复制、转录、剪接或转译)达成。 该VEGF、VEGFR、LacCer合成酶、PECAM-1的序列揭露于GenBank Accession Nos.AF38663(GalT-V)、AF38664(GalT-VI)、NM_008816、 NM_000442(PECAM1)、NM_077435、NM_001025370、NM_001025369、 NM_001025368、NM_001025367、NM_003376、NM_001025366、(VEGF)、 X94263、XM_497921、AB065372、AJ319908、D64016、NM_002019、(VEGFR) 及NM_000300、BC005919、(PLA2),其全部内容幷入本文以兹参考。

太阳城集团RNAi是非常有效的程序,它是藉由双链RNA(dsRNA)在动物及植物 细胞中诱导该同源性mRNA的序列特异性降解(Hutvagner and Zamore (2002),Curr.Opin.Genet.Dev.,12,225-232;Sharp(2001),Genes Dev.,15,485-490)。在哺乳类细胞中,RNAi可藉由微小干扰RNA(siRNA) 的21-核苷酸(nt)双螺旋触发(Chiu et al.(2002),Mol.Cell.,10, 549-561;Elbashir et al.(2001),Nature,411,494-498),或藉 由微RNAs(muRNA)、功能小发夹RNA(shRNA)、或其他藉由使用带有RNA 聚合酶III启动子的DNA模板在体内表达dsRNA(Zeng et al.(2002), Mol.Cell,9,1327-1333;Paddison et al.(2002),Genes Dev.,16, 948-958;Lee et al.(2002),Nature Biotechnol.,20,500-505; Paul et al.(2002),Nature Biotechnol.,20,505-508;Tuschl,T. (2002),Nature Biotechnol.,20,440-448;Yu et al.(2002),Proc. Natl.Acad.Sci.USA,99(9),6047-6052;McManus et al.(2002), RNA,8,842-850;Sui et al.(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 99(6),5515-5520)。

太阳城集团本发明特别介绍「微小干扰RNA分子(「siRNA分子」或「siRNA」)」, 制造该siRNA分子的方法及供使用该siRNA分子的方法(例如研究及/ 或治疗方法)。本发明的siRNA分子是由正义链与互补反义链所组成的 双链分子,该反义链具有足以互补于标靶mRNA去操控RNAi。较佳地, 该链是对齐的,所以有至少该没有对齐的链终端的1、2或3碱基(例 如在相对链中发生的不互补碱基),所以1、2或3残基的悬端发生在 当链被退火时该双螺旋的一或二终端。较佳地,该siRNA分子具有约 10至50或更多个核苷酸的长度,例如每一链包括10至50个核苷酸(或 核苷酸类似物)。更佳地,该siRNA分子在每一链中具有约16至30个 (例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30)的核苷酸长度,其中该链的一个是本质上互补于,例如至少 80%(或更高,例如85%、90%、95%、或100%)互补于,例如具有3、2、 1或0个不匹配的核苷酸,标靶区,该标靶区藉由该野型与突变等位基 因(allele)之间的至少一碱基对区隔,例如标靶区包括该获得性 (gain-of-function)突变体,而其他链对于该第一链微小干扰RNA分 子是相同或本质上相同。

在一实施例中,是藉由使用太阳城集团如RNAi的RNA干扰技术去抑制该 VEGF、VEGFR、LacCer合成酶、PECAM-1一个或多个的表达。RNAi以高 效及特定方式允许该标靶基因表达的选择敲低(knockdown)。这太阳城集团将 双链RNA(dsRNA)导入细胞的技术,具有序列是对应于该标靶基因的外 显子部分。该dsRNA造成该标靶基因的mRNA消灭。参考,例如Hammond et al.,Nature Rev Gen 2:110-119(2001);Sharp,Genes Dev 15:485-490(2001),二者全部内容并入本文以兹参考。

RNAi技术成功使用的方法与程序是本领域已知的,并已描述于,例 如,Waterhouse et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(23): 13959-13964(1998)。本发明的该RNAi包括任何可调整该VEGF、VEGFR、 LacCer合成酶、PECAM-1 mRNA一个或多个的选择性降解的siRNAs。

本发明的siRNAs包含「双链微小干扰RNA分子」(「ds-siRNA」) 与「单链微小干扰RNA分子」(「ss-siRNA」)、制造该siRNA分子的 方法与使用该siRNA分子的方法(例如研究及/或治疗方法)。

类似于该ds-siRNA分子,该ss-siRNA分子具有约10至50个或更 多核苷酸的长度。更佳地,该ss-siRNA分子具有约15至45个核苷酸 的长度。甚至更佳地,该ss-siRNA分子具有约19至40个核苷酸的长 度。本发明的该ss-siRNA分子进一步具有序列,其是「足够地互补于」 标靶mRNA序列以命令专一标靶RNA干扰(RNAi),例如,本文所定义的, ss-siRNA具有序列,是足以藉由该RNAi装置或程序触发该标靶mRNA 的消灭。该ss-siRNA分子可被设计,所以每个残基是互补于该标靶分 子内的残基。可替代地,可在分子内制造取代基以增加稳定性及/或增 强该分子处理活性(processing activity)。可在链中制造取代基或可 制成位于该链终端的残基。该5’终端最佳地是磷酸化的(例如包括磷 酸盐、二磷酸盐、会三磷酸盐基团)。该siRNA的3’终端可能是羟基 以促进RNAi,由于当该活性试剂是ss-siRNA分子时就不需要3’羟基。 特征是ss-siRNA分子,其中该3’终端(例如该3’糖的C3)缺乏羟基 (例如ss-siRNA分子在3’糖(例如核糖或脱氧核糖)缺乏3’羟基或C3 羟基)。

太阳城集团本发明的该siRNAs包括修饰它们的磷酸盐糖主链或核苷。这些修 饰可被量身订制以提升选择性基因抑制,而避免在一些细胞中藉由 siRNA产生报告中普遍惊恐的反应。此外,修饰可导入该碱基以保护 siRNAs避免该一个或多个内源性酶的作用。

太阳城集团本发明的该siRNA以酶制造或全部或部分地合成。此外,本发明的 该siRNAs可在体内或体外合成。针对生物合成的siRNAs,内源性或克 隆的外源性RNA聚合酶可用于体内转录,而克隆的RNA聚合酶可用于 体外。化学地或酶合成的siRNAs较佳的是在导入该细胞前纯化。

虽然该siRNA与该标靶区之间的100百分比的序列相同是较佳的。 但不需要去实施这发明。包含一些在该序列中修饰程度的siRNA分子 也可适当地供本发明目的使用。该修饰包括,不论是自然发生或刻意 地导入,亦不限于突变、删除或插入。可用于抑制VEGF、VEGFR、LacCer 合成酶、PECAM-1一个或多个表达的特定siRNA例子描述于例子7。

太阳城集团藉由siRNAs引导的该标靶RNA分离反应是高度序列特定性的。大 体而言,包含与该标靶基因部分相同的核苷酸序列的siRNA供抑制作 用是较佳的。然而,该siRNA与该标靶区之间的100%的序列相同是不 需要去实施本发明。因此,本发明具有能够容忍序列变化的优点,该 序列变化可能预期是因为基因突变、链多态、或进化分化。例如,相 对于该标靶序列,带有插入删除及单点突变的siRNA序列已发现对于 抑制作用是有效的。可选择地,带有核苷酸类似物取代基或插入的 siRNA序列可对抑制作用是有效的。

太阳城集团此外,并非所有siRNA的位置都同样对标靶识别有贡献。该siRNA 中心的失配是最严重的且本质上破坏标靶RNA分离。相对地,该siRNA 的3’核苷酸对于该标靶识别的特定性没有显物的贡献。尤其,互补于 该标靶RNA(例如该引导序列)的该siRNA的3’残基对于标靶RNA分离 是不严重的。

太阳城集团序列相同度可藉由该领域已知的序列比对与对齐算法确定。为确定 两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的相同度百分比,该序列是以最理 想比较目的对齐(例如间隙可导入该地依序列或第二序列作最理想对 齐)。接着比对在对应的核苷酸(或氨基酸)位置的该核苷酸(或氨基酸 残基)。当第一序列中的位置被该相同残基占据作为该第二序列对应的 位置,那么该分子在那位置是相同的。该两序列之间的相同度百分比 是该序列共享相同位置数的函数(例如相似度%=相同位置数目/全部位 置数目X100),视情况地对该导入间隙的数目及/或导入间隙的长度扣 分。

该序列的比对以及两序列之间相同度百分比的确定可使用数学演 算法达成。在一实施例中,该对齐是产生在经过比对后具有足够相同 度的序列特定部分,而不在于具有低程度相同的特定部分(例如局部的 对齐)。较佳的且不限于局部对齐演算法的例子,而且是供该序列比对 使用的例子是Karlin与Altschul的该演算法(1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87:2264-68;Karlin and Altschul修饰于(1993)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90:5873-77。该演算法并入Altschul,et al.的该 BLAST程序(2.0版本)(1990)J.MoI.Biol.215:403-10。

在另一实施例,该对齐是藉由导入适当的间隙作最佳化而且相同度 百分比是确认在该对齐的序列长度(例如间隙化对齐)。为得到比对目 的的间隙化对齐,间隙化BLAST可使用Altschul et al.,所叙述的内 容(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402。在另一实施例, 该对齐是藉由导入适当的间隙作最佳化而且相同度百分比是确认在该 对齐序列的整体长度(例如总体对齐)。较佳的且不限于供使用于序列 总体比对的数学演算法例子是Myers与Miller的该演算法CABIOS (1989)。该演算法并入ALIGN程序(2.0版本),其是GCG序列对齐软件 包的部分。当使用ALIGN程序作氨基酸序列比对时,使用PAM120重量 残基表、12分的间隙长度扣分、及4分的间隙扣分。

在该siRNA与该标靶基因的部分之间,高于90%的序列相同度,例 如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%的序 列相同度是较佳的。可选择地,该ss-siRNA可能功能地定义为核苷酸 序列(或寡核苷酸序列),其是有能力与该标靶基因转录部分杂交 (400mM的NaCl、40mM的PIPES pH值6.4、1mM的EDTA、50℃或70℃ 杂交12至16小时,接着清洗)。更较佳的杂交条件包括,在70℃的 1XSSC中或50℃的1XSSC中,50%的甲酰胺杂交,接着在70℃的0.3XSSC 中清洗;或在70℃的4XSSC中或50℃的4XSSC中,50%的甲酰胺杂交, 接着在67℃的1XSSC中清洗。预料是小于50个碱基对长度的杂交体, 该杂交温度应该在5至10℃,低于该杂交体的熔点(Tm),其中该Tm 是根据该下列方程式确定。小于18个碱基对长度的杂交体, Tm(℃)=2(A+T碱基数量)+4(G+C碱基数量)。18至49个碱基对之间长 度的杂交体,Tm(℃)=81.5+16.6(loglO[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N), 其中N是杂交体中的碱基数量,而[Na+]是杂交缓冲液中该钠离子的浓 度(1XSSC的[Na+]浓度为0.165M)。多核苷酸杂交严谨条件的更多例子 提供在Sambrook,J.,E.F.Fritsch、及T.Maniatis,1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,chapters 9 and 11、 及Current Protocols in Molecular Biology,1995,F.M.Ausubel et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,sections 2.10 and 6.3-6.4, 其内容并入本文以兹参考。该相同的核苷酸序列长度可能至少约10、 12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47或 50个碱基。

在较佳的态样中,本发明的该RNA分子是被修饰以提供细胞培养 的血清或生长媒介质稳定。为了提升该稳定性,该3’残基可能被稳定 去对抗降解,例如它们可能经过选择,因此是由嘌呤核苷酸组成,尤 其是腺苷或鸟苷核竿酸。可选择地,藉由修饰类似物的嘧啶部位取代 基,例如藉由2’-脱氧胸苷的尿苷取代基是可容忍的,而且并不影响 该RNA干扰的效率。例如,不存在2’羟基可能会显著提升组织培养媒 介质中该siRNAs的耐核酸酶性。

本发明的实施例中,该RNA分子可能包含至少一种修饰过的核苷 酸类似物。该核苷酸类似物位置可能在该标靶专一活性位,例如该RNAi 媒介活性无本质上被影响,例如在该RNA分子的5’终端及/或3’终 端的区域。尤其,可能藉由并入修饰过的核肝酸类似物稳定该终端。

太阳城集团较佳的核苷酸类似物包括糖修饰及/或主链修饰的核糖核苷酸(例 如包括对该磷酸盐糖主链的修饰)。例如,可能修饰该中性RNA的磷酸 二酯键以包括至少氮或硫杂原子中的一个。较佳的主链修饰核糖核苷 酸,连接至相邻的核糖核苷酸的该磷酸酯基是藉由修饰基置换,例如 硫代磷酸酯(phosphothioate)基。较佳的糖修饰核糖核苷酸,该2’OH 基是藉由选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON基取代, 其中R是C1至C6烷基、烯基或炔基而卤素是F、Cl、Br或I。

同样较佳的是核碱基(nucleobase)修饰的核糖核苷酸,例如核糖 核苷酸,其包含至少一种非自然发生核碱基而非自然发生的核碱基。 碱基可能被修饰去阻碍该腺苷腺嘌呤酶的活性。例示性的修饰核碱基 包括,但不限于在5号位置修饰的尿苷及/或胞苷,例如5-(2-氨基) 丙基尿苷、5-溴尿苷;在8号位置修饰的腺苷及/或鸟苷,例如8-溴鸟 苷;脱氮核苷酸,例如7-脱氮-腺苷;O-及N-烷基化核苷酸,例如N6- 甲基腺苷是合适的。应注意的是可能组合该上述修饰。

太阳城集团本发明的该核酸组合物包括如本文所述的siRNA与siRNA衍生物 二者。例如,可运用交联以改变该组合物的药物动力学,例如,增加 体内半生期。因此,本发明包括siRNA衍生物,其包括具有核酸的两 个互补链siRNA,而该两个链是交联的。本发明也包括具有结合至自身 的3’终端(例如肽)、有机组合物(例如染料)、或该类似物的非核酸部 位的siRNA衍生物。以这种方式修饰siRNA衍生物可能改进细胞摄取, 或相较于该对应siRNA提升了该产生siRNA衍生物的细胞标靶活性, 该修饰对于在该细胞内追踪该siRNA衍生物是有用的,或者相较于该 对应siRNA改善了该siRNA衍生物的稳定性。

太阳城集团本文中所提及的资料文件全部内容并入本文以兹参考。

例子

以下进一步由非限制性例子说明本发明

例1

试剂-扩充的材料与方法可在http://circres.ahaiournal s.org取得线上补充资料。

太阳城集团细胞培养-人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)与内皮细胞生长媒介质 EGMTM是购买自Cambrex(Walkersville,MD),并培养在加有10%的胎 牛血清(FBS)的EGMTM培养基。缺乏内源性PECAM-1表达与REN (mt-rhPECAM-1)表达人类PECAM-1的人类内消旋内皮瘤细胞系[(REN- 野生型(WT))]是由Dr.Steven Albelda,University of Pennsylvania Medical Center,USA.REN-WT慷慨提供,该细胞系生长于加有10%FBS 的RPMI中。REN(mtrhPECAM-1)是培养于带有G418(0.5g/L Gibco)的 相同培养基中。

太阳城集团LacCer合成的确定-在指示的太阳城集团间隔,将细胞以PBS清洗三次并 萃取脂质,并且执行如前述藉由HPLC确定鞘糖脂。

LacCer合成酶活性的确定-是使用如前述UDP-[14C]半乳糖作为核 苷酸糖供体以及葡萄糖神经酰胺作为受体测量以VEGF培养的细胞中该 LacCer合成酶的活性。

太阳城集团LacCer合成酶(GalT-V siRNA)的合成与转染-根据该(N19)TT规则, 该人类GalT-V cDNA的siRNA序列[基因银行编号AF038663]分别是 5’-CGG AGU GAG UGG CUU AAC A dTdT-3’(正义)、5’-UGU UAA GCC ACU CAC UCC G dTdT-3’(反义)。使用的零乱的(负控制)siRNA分别是5’- AUG GUG AUU AGA CUG UAC C dTdT-3’(正义)、5’-AAG CGU ACU AGG AUC AGU A dTdT-3ψ(反义)。HUVECs是使用阳离子脂质体 (Oligofectamine)(Invitrogen公司)转染siRNA。

太阳城集团实时逆转录PCR-实时RT-PCR是以Bio-Rad iCycler系统实施。该引 物对是由1st BASE(Singapore)被设计(引物探求整合(Primer Quest- Integrated)DNA技术)与合成。PECAM-1该引物序列分别如下:(正)5’ TGACCCTTCTGCTCTGTT 3’及(逆)5’TGAGAGGTGGTGCTGACATC 3’。β-肌 动蛋白引物分别是(正)5’AGGTCATCACTATTGGCAACGA 3’及(逆)5’ CACTTCATGATGGAATTGAATGTAGTT 3’。热循环条件如下:在94℃初始变 性10分钟,接着分别在94℃/30秒、60℃/40秒及72℃/1分钟作 40个扩增循环。最后在72℃、10分钟完成延伸。

西方免疫转渍法分析(Western Immunoblot Analysis)-藉由10% SDS-PAGE分解25克的蛋白并接着转移至硝酸纤维素膜。藉由山葵过 氧化酶结合二次抗体(horseradish peroxidase-conjugated secondary ant ibody)使用化学发光试剂盒显现该膜结合型初代抗体。 接着使用分子动力影像扫描器对该薄膜作密度扫描,并使用Image Quant软件作分析。

体外血管新生/管子形成试验-体外血管新生试验是使用Chemicon 公司(Temecula,CA)贩售的套件实施。

统计分析-所有试验是以二重测定或三重测定执行并以平均数± 标准方差(±S.D)表达。学者的t测验是用于评估该数据统计的意义。 P<0.05是被认为重要的。

例2

太阳城集团VEGF诱导PECAM-1 mRNA及蛋白质表达

太阳城集团藉由不同浓度的VEGF(5至30ng/ml)与不同太阳城集团间隔培养HUVECs 确定该VEGF对PECAM-1表达的效果。在该PECAM-1 mRNA的表达存有 剂量依赖性。当以VEGF(30ng/ml、4小时)治疗HUVECs时,藉由实时 RT-PCR确定,观察到PECAM-1最大的mRNA表达(图1A)。类似地,当 不同太阳城集团点用25ng/ml的VEGF治疗HUVECs时,如藉由实时RT-PCR 确定,在4至5小时观察到最大的PECAM-1 mRNA表达之后就减少(图 1B)。进一步地,以VEGF(30ng/ml)培养4小时后,PECAM-1蛋白质表 达是最大的(图1C)。当HUVECs以VEGF(25ng/ml)培养不同的太阳城集团间隔, 在4小时时PECAM-1蛋白质表达是最大的(图1D)。

例3

太阳城集团VEGF刺激LacCer合成并藉由D-PDMP消除

如图2A所示,以VEGF(25ng/ml)治疗HUVECs,在太阳城集团依赖模式中 显著地刺激该LacCer的重新合成[(图2A、区块A)开口范围],其提早 在培养的10分钟发生,但之后在VEGF治疗的细胞持续高水平。明显 相对地,以20μM的D-PDMP预治疗HUVECs[(双醣脂(glycosylceramide) 合成酶的抑制;其阻挡由神经酰胺该葡萄糖神经酰胺(GlcCer)的合成) 与合成LacCer]缓和VEGF诱导的LacCer生物合成[(图2A、区块A)实 心范围]。VEGF也刺激GlcCer[(图2A、区块B)开口范围]的生物合成 以及D-PDMP预治疗提早在培养的10分钟抑制了VEGF诱导的GlcCer 合成[(图2A、区块B)实心范围]。另一方面,GbOse3Cer的水平、LacCer 的α-半乳糖化产物、在VEGF治疗细胞中的合成、带有及不带有D-PDMP 是类似的(未显示数据)。

例4

藉由D-PDMP消除以及藉由LacCer反转VEGF诱导的PECAM-1表达

与D-PDMP(10至30μM)作HUVECs的预培养,施加VEGF诱导的 PECAM-1表达的浓度依赖性抑制(图2B)。与D-PDMP(20μM)作HUVECs 的预培养90分钟,接着藉由和VEGF(25ng/ml)培养也消除了PECAM-1 mRNA及蛋白质表达,而这是藉由LacCer绕道(图2C、3B)。

例5

LacCer特定地对PECAM-1表达及血管新生反转该D-PDMP的抑制效果

当HUVECs与GlcCer、DGDG或C2神经酰胺(每一个皆为2.5μM)培 养4小时,并不会诱导PECAM-1表达(图3A)。此外,以D-PDMP治疗 HUVECs,接着与GlcCer、DGDG或C2神经酰胺培养无法对于PECAM-1表达 (图3B)及血管新生(图3C-区块e、f及图3D)将该D-PDMP的抑制效果绕 道。相对地,LacCer显著地诱导PECAM-1表达及血管新生且不受D-PDMP 及VEGF的存在与否影响(图3B、C-区块b及图3D)。这些观察结果暗示 VEGF诱导的PECAM-1表达及血管新生是紧密相太阳城集团LacCer并藉由 LacCer调节。

例6

太阳城集团苯基棕榈酰胺吗啡丙醇(PPMP)抑制VEGF诱导的PECAM-1表达及血管新 生并藉由LacCer绕道

发现与PPMP(20μM)(特定供葡萄糖神经酰胺合成酶的抑制剂)作 HUVECs的预培养,造成VEGF诱导的PECAM-1表达及血管新生的缓和(图 4A和B)。对于VEGF诱导的PECAM-1表达及血管新生,LacCer反转该 PPMP抑制效果(图4A和B)。GlcCer也反转了太阳城集团PECAM-1表达与血管 新生的该PPMP抑制效果(图4A和B),但是不及于LacCer。因此,这 些发现暗示LacCer合成酶的VEGF标靶是在HUVECs中PECAM-1表达与 血管新生的关键。

例7

LacCer合成酶(GalT-V)基因脱落缓和PECAM-1表达与血管新生

为了研究是否LacCer特定地需要去媒介VEGF诱导的PECAM-1表 达与血管新生,我们直接对人类GalT-V使用siRNA双螺旋去沉默 GalT-V基因表达。西方免疫转渍试验是使用由HUVECs和突变CHO细胞 系的二个个别制备物所制备的细胞裂解液过表达GalT-V,显示该兔子 的多克隆GalT-V抗体(IgG)明确地以明显的约55kDa的分子重量和 GalT-V反应(图5A)。此外,GalT-V专一的siRNA双螺旋(100nM)转染 显著地减小(约70%GalT-V)HUVECs中蛋白质表达(图5B)。再者,当与 零乱的siRNA治疗细胞比较,这些细胞内的该GalT-V酶活性也减小约 62%(图5C)。进一步地,研究对于PECAM-1表达与血管新生VEGF在 GalT-V沉默的HUVECs中的效果。在PECAM-1表达没有观察到改变(图 6A),且当与零乱的siRNA转染细胞比较(图6B-区块B),在以LacCer 合成酶(GalT-V)沉默的VEGF治疗细胞中观察到减弱的血管新生。这些 结果提供LacCer是在HUVECs中媒介VEGF诱导的PECAM-1表达与血管 新生的证据。

例8

PECAM-1是VEGF/LacCer诱导血管新生所需

为了研究是否PECAM-1是VEGF/LacCer诱导血管新生所绝对需要, 我们以PECAM-1单克隆抗体预治疗HUVECs,接着以VEGF或LacCer培养。 在PECAM-1mAb(单克隆抗体)而非小鼠IgG预治疗细胞中,VEGF/LacCe 后治疗不会显著地诱导血管新生(图7A、区块e、f和g)。进一步地,为 了解是否PECAM-1对于VEGF/LacCer血管新生是重要的,我们对REN(WT) 细胞进行实验,该细胞表现型地类似内皮细胞,但是缺乏内源性 PECAM-1表达。另一方面,如前述根据在REN WT以及建立的REN (mt-rhPECAM-1)转染PECAM的组成型表达的CMV启动子,2.5kb全人类 PECAM-1cDNA被克隆成哺乳类表达载体pcDNA3(Invitrogen公司)。27当 与2%FBS治疗的细胞比较(图8A),在REN(WT)细胞中VEGF/LacCer无 法在该体外血管新生试验中形成类似管子结构(图8B、C)。另一方面, 在以人类PECAM-1基因转染的REN细胞中,当与控制组比较(图8D),在 该体外血管新生试验VEGF/LacCer诱导管子形成(图8E、F)。因此,这 些实验结果显示PECAM-1表达是VEGF/LacCer诱导血管新生所需的,此 外,观察到VEGF受体(KDR/Flk-1)拮抗剂SU1498所做的HUVECs预治疗, 接着以VEGF而非LacCer培养是无法诱导管子形成/血管新生,这暗示该 KDR/Flk-1对VEGF的需要去引起血管新生(图7c、d及h)。这些观察暗 示LacCer是VEGF诱导的信号途径该KDR/Flk-1的下游,该途径是导致在 HUVECs中PECAM-1表达与血管新生。

例9

PKC与PLA2抑制剂缓和LacCer诱导的血管新生

当与载体(DMSO)单独治疗的细胞比较,PKC抑制剂CC(5.0μM)、 G 6850及6976(50nM)与PLA2抑制剂BPB(10μM)及MAFP(3.0μM) 消除VEGF/LacCer诱导的PECAM-1表达(参照图1A线上补充资料)与管子 形成(参照图1B线上补充资料)。这暗示藉由招募PKC与PLA2,LacCer诱 导PECAM-1表达,以及这些是下游信号事件,也就是LacCer可招募去诱 导PECAM-1表达与血管新生。

例10

太阳城集团经由NF-κB活化作用VEGF/LacCer诱导PECAM-1表达

以抗氧化剂(例如NAC、NAPDH氧化酶抑制剂(DPI)或NF-κB抑制剂 (PDTC))作HUVECs的预治疗,显著地减弱VEGF/LacCer诱导的 PECAM-I(参照图2A线上补充资料)与胞质NF-κB表达(参照图2A线上补 充资料)。这些结果暗示VEGF诱导的LacCer重新合成,可选择地外源添 加的LacCer可触发自由基产生,推测经由可活化NF-κB的NADP(H)氧 化酶去诱导PECAM-1表达。17-19

例11

太阳城集团L-PDMP刺激PECAM-1表达与血管新生

太阳城集团以往表明过L-PDMP是LacCer合成酶的强效活化剂。17、30因此,确定 的是对于PECAM-1表达与血管新生L-PDMP是有效的。当细胞以L-PDMP 增加的浓度治疗时,其显著地诱导PECAM-1表达(参照图3A线上补充资 料)与血管新生(参照图3B线上补充资料)。这些观察显示PDMP立体易构 物是太阳城集团LacCer合成酶的上调与下调、PECAM-1表达与血管新生。

为了确定在诱导血管新生方面VEGF可能招募LacCer的机制,使用 药物学与分子的方法二者而去操作负责LacCer生物合成酶。既然VEGF 诱导LacCer合成酶活性,首先我们使用D-PDMP,最初被表示为GlcCer 的抑制剂33而后来被证明是纯化的LacCer合成酶抑制剂。30、33、34我们的 研究提供证明藉由D-PDMP以剂量依赖性模式抑制了VEGF诱导的 LacCer/GlcCer合成,PECAM-1基因/蛋白质表达与血管新生。此外,这 抑制效果是藉由LacCer绕道而非GlcCer,这暗示VEGF瞄准LacCer合成 酶去诱导血管新生。近来,Pannu35证明IFN(干扰素)或脂多糖 (lipopolysaccharide)(LPS)在神经源细胞中治疗也招募LacCer去诱 导可诱导的一氧化氮合成酶(iNOS)并加速小鼠脊髓损伤;TNF诱导的星 形细胞增生与在大鼠脊髓损伤中星形细胞增生。这些事件是藉由 D-PDMP以及LacCer合成酶反义媒介的沉默(GalT-2)消除。36

过去,D-PDMP已被表示缓和轴突长出并改善破骨细胞(osteoclast) 形成37、38与大动脉平滑肌细胞增生。15虽然D-PDMP也可藉由提升神该经 酰胺的细胞水平去诱导雕亡,如上述研究。37、38,而且在该研究中 D-PDMP(20μM)直到4至6小时还不会诱导在HUVECs中的凋亡(未显示 数据)。整体而言,在体内与体外多表现形变化中D-PDMP已被广泛地用 以描述该LacCer合成酶/LacCer的角色。相对地,刺激该LacCer合成酶 活性30的立体异构物L-PDMP,在我方研究中刺激了PECAM-1表达与血管 新生。因此PDMP的立体异构物,藉由LacCer合成酶的功效可改变表现 型变化,例如前述研究中的细胞增生15-22与血管新生/管子形成。

太阳城集团为了进一步确定该VEGF作用标靶是LacCer而不是GlcCer,我们 使用PPMP,一种GlcCer合成酶的特定抑制剂。再者,类似PPMP,D-PDMP 也缓和VEGF诱导PECAM-1表达与血管新生而且这是藉由LacCer绕道。 一种更直接的方式去确定于我方研究在VEGF诱导PECAM-1表达与血管 新生中该LacCer合成酶/LacCer的角色,是使用siRNA媒介的基因脱 落。该LacCer合成酶/GalT-V表达是在HUVEC沉默且接着比较其对VEGF 诱导的PECAM-1表达与血管新生的效果。总结在图6A、6B的结果暗示 LacCer合成酶(GalT-V)siRNA在HUVECs中沉默,贡献了减少约70%在 该GalT-V基因/蛋白质脱落并且缓和VEGF诱导的PECAM-1基因表达与 血管新生。

太阳城集团我方的研究中,REN细胞(没有PECAM-1的细胞)对于VEGF/LacCer 诱导的血管新生是无反应的。相对地,在REN细胞表达PECAM-1全长cDNA 的VEGF/LacCer治疗,在血管新生体外试验对太阳城集团PECAM-1与类似管子 的形成有强烈地反应(图8)。也观察到在HUVECs中该PECAM-1抗体的使 用缓和了血管新生10、11。因此LacCer的药物学及/或基因操作逆向地影 响PECAM-1基因/蛋白质表达与血管新生。

PKC/PLA2特定抑制剂的使用,在本研究中发现,VEGF诱导LacCer 重新合成并接续地招募PKC/PLA2去诱导HUVECs中血管新生/管子形成。 此外,我方也以文件证明在前单核细胞系(U-937)中,LacCer特定地刺 激该胞质PKCα/ε的易位至该细胞薄膜,其被认为是因为这些蛋白质 的活化作用。22

最近,对于在肿瘤血管新生中该1-磷酸鞘氨醇受体-1的要求是使 用体内RNA干扰证明。41本研究点出该方向,既然血管新生是关键的多 方面生理事件,细胞可能招募各种的鞘脂类以符合该器官修复、生长 及发育的要求。我方的研究指出使用抗体对抗PECAM-1、LacCer合成酶 抑制剂及/或GalT-VsiRNA可缓和VEGF诱导的血管新生并可能在抗血管 新生治疗方面良好地作为无可估价的药物试剂。

本发明已详细地描述,并参照其较佳的实施例。然而,将可了解 的是该领域熟悉该项技术者,根据本说明书考量的内容可能做的修饰 与改良,是不脱离下列该所提出权利要求的精神与范围。

参考资料

1.Folkman JC.Angiogenesis in cancer,vascular,rheumatoid and other diseases.Nat Med 1995;1:27-31.

太阳城集团2.Neufeld G,Cohen T,Gengrinovitch S,Poltrorak Z. Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors. FASEB J.1999;13:9-22.

太阳城集团3.Ferrara N.Vascular endothelial growth factor.Eur J Cancer.1996;32:2413-2422.

太阳城集团4.Petrova TV,Makinen T,Alitalo K.VEGF expression in human coronary atherosclerotic lesions:possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis.Exp Cell Res.1990;253:117-130.

5.Brasen JH,KiuelA,Rser K,Rissanen TT,Niemi M,Luft FC,Donath K,YlaHerttualas.Angiogenesis,VEGF and platelet-derived growth factor BB expression,iron deposition and oxidation-specific epitopes in stented human coronary arteries.Arterioscler Throm Vas Biol.2001;21:1720-1726.

太阳城集团6.Zhao Q,Egashira K,Inoue S.Vascular endothel ial growth factor is necessary in the development of atherosclerosis by recruiting monocytes in a rat model of long-term inhibition of nitric oxide synthesis.Circulation.2002;105:1110-1115.

7.Newman PJ.The biology of PECAM-I.JClinInvest.1997; 99:3-8.

8.Ilan N,Madri JA.PECAM-I:old friend,new partners. Curr Opin Cell Biol.2003;15:515-524.

太阳城集团9.DeLisser HM,Solomindu CM,Strieter RM.Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.Am J Pathol.1997;151: 671-677

太阳城集团10.Cao G,Obrein CD,Zhou Z,Sanders SM,Greenbaum NJ, DeLisser HM.Involvement of human PECAM-I in angiogenesis and in vitro endothelial cell migration.Am J Cell Physiol.2002; 282:C1181-1190.

11.Ji G,O’Brien CD,Feldman M,Manevich Y,Lim P,Sun J, Albelda SM,Kotlikoff MI.PECAM-I(CD31)regulates a hydrogen peroxide-activated nonselective cation channel in endothelial cells.J Cell Biol.2002;157:173-184.

12.Zhou Z,Christofidou-Solomildou M,Garlanda C,DeLisser HM.Antibody against murine PECAM-I inhibits tumor angiogenesis in mice.Angiogenesis.1999;3:181-188.

13.O’Brein CD,Cao G,Makriginnakis A,DeLisser HM.Role of immunoreceptor tyrosine-based motifs of PECAM-Iin PECAM-I dependent cell migration.AmJPhysiol Cell Physiol.2004;287: C1 103-1113.

14.Hakomori  SI,Igarashi Y.Gangl iosides and glycosphingolipids as modulators of cell growth,adhesion,and transmembrane signaling.Adv.Lipid Res.1993;25:147-162

15.Chatterjee S.Lactosylceramide stimulates aortic smooth muscle cell proliferation.Biochem Biophys Res Commun. 1991;181:554-561.

太阳城集团16.Chatterjee,S.,Bhunia,A.K.;Snowden,A.;Han,H. Oxidized low density lipoproteins stimulate galactosyltransferase activity,ras activation,p44 mitogen activated protein kinase and c-fos expression in aortic smooth muscle cells.Glycobiology 1997;7:703-710

太阳城集团17.Bhunia AK,Han H,Snowden A,Chatterjee S. Redox-regulated signaling by lactosylceramide in the proliferation of human aortic smooth muscle cells.J Biol Chem. 1997;271:15642-15649.

太阳城集团18.Chatterjee S.Oxidized LDL and lactosylceramide both stimulate the expression of proliferating cell nuclear antigen and proliferation of aortic smooth muscle cells.Indian J Biochem Biophys.1997;34:56-61

太阳城集团19.Bhunia AKL,Arai T,Bulkey G,Chatterjee S. Lactosylceramide mediates tumor necrosis factor-(TNF-) induced intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)expression and the adhesion of neutrophil in human umbilical vein endothelial cells.J Biol Chem.1998;273:34349-34357.

20.Arai T,Bhunia AK,Chatterjee S,Bulkley GB. Lactosylceramide stimulates human neutrophils to upregulate Mac-1,adhere to endothelium,and generate reactive oxygen metabolites in vitro.Circ Res.1998;82:540-547.

太阳城集团21.Chatterjee S,Shi WY,Wilson P,Mazumder A.Role of lactosylceramide and MAP kinase in the proliferation of proximal tubular cells in human polycystic kidney disease.J Lipid Res. 1996;37:1334-1344.

太阳城集团22.Gong N,Wei H,Chowdhury HS,Chatterjee S. Lactosylceramide recruits PKCα/εand phospholipase A2 to stimulate PECAM-1 expression and adhesion of human monocytes to endothelial cells.(2004)Proc Natl Acad Sci U.S.A.2004;101: 64906495

23.Chatterjee S,Sekerke CS,Kwiterovich PO.Increased accumulation of glycosphingolipids in familial hypercholesterolemia.J Lipid Res.1982;23:513522.

24.Mukhin D,Chao FF,Kruth HS.Glycosphingolipid accumulation in the aortic wall is another feature of human atherosclerosis.Arterioscler Thromb Vase Biol.1995;15: 1607-1615.

太阳城集团25.Chatterjee SB,Dey S,Shi WY,Thomas K,Hutchins GM. Accumulation of glycosphingolipids in human atherosclerotic plaque and unaffected aorta tissues.Glycobiology 1997;7: 57-65.

26.Serebruany VL,Murugesan SR,Pothula A,Semaan H,Gurbel PA.Soluble PECAMl,but not P-selectin,nor osteonectin identify acute myocardial infarction in patients presenting with chest pain.Cardiology 1999;91:50-55.

27.Zibara K,Chignier E,Covacho C,Poston R,Canard G, McGregor J.Modulation of expression of endothelial intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),PECAM-1 and VCAM-1 in aortic arch lesions in apolipoprotein E-deficient compared with wild-type mice.Arterioscler Thromb Vase Biol.2000;20: 2288-2296.

28.Indira  Gurubhagavatula,Yassine  Amrani,Domenico Pratico,Frederick L.Ruberg,Steven M.Albelda,and Reynold A. Panettieri,Jr.Engagement of human PECAM-1(CD 31) on human endothelial cells increases intracellular calcium ion concentration and stimulates prostacyclin release.J Clin Invest. 1998;101:212-222.

29.Iwabuchi K,Nagaoka I.Lactosylceramide - enriched glycosphingolipid signal ing  domain mediates superoxide generation in human neutrophils.Blood.2002;24:59425954.

太阳城集团30.Chatterjee S,Cleveland T,Shi WY,Inokuchi J,Radin NS. Studies of the action of ceramide-like substances(D-and L-PDMP) on sphingolipid glycosyltransferases  and purified lactosylceramide synthase.  Glycoconj J.1996;13:481-486.

31.Dvorak HF,Nagy JF,Feng D,Brown LF,Dvorak AM.Vascular permeability factor/VEGF and the significance of microvascular hyperpermiability in angiogenesis.Curr Top Microbiol Immunol. 1999;237:97-132.

太阳城集团32.Strawn LM,McMahon G,App H,Schreck R,Kuchler W,Longhi MP,Hui H,Tang C,Levitzki A,Gazit A,Chen I et al.FLK-1 as a target for tumor inhibition.Cancer Res.1996;56:3540- 3545.

太阳城集团33.Inokuchi J,RadinNS.Preparation of the active isomer of 1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-l-propanol, inhibitor of murine glucocerebroside synthase.J Lipid Res.1987; 28:565-571.

34.Chatterjee S,Ghosh N.Oxidized low density lipoprotein stimulates aortic smooth muscle cell proliferation. Glycobiology 1996;6:303-311.

太阳城集团35.Pannu S,Won JS,Khan M,Singh AK,Singh I.A novel role of lactosylceramide in the regulation of lipopolysaccharide/interferon-g mediated iNOS synthase gene expression:implications for neuroinflammatory diseases. JNeurosci.2004;24:5942-5954.

36.Pannu R,Singh AK Singh I.A novel role of lactosylceramide in the  regulation of TNF-α-mediated proliferation of rat primary astrocytes.Implications for astrogliosis following neurotrauma.J Biol Chem.2005;280: 316-324.

37.Mutoh T,Tokuda A,Inokuchi J,Kuriyama  M. Glucosylceramide sythase inhibitor inhibits the action of nerve growth factor in PC 12 cells.J Biol Chem.1998;273: 26001-26007.

38.Iwamoto T,Fukumoto S,Kanaoka K,Sakai E,Shibata M, Furukawa K,Kato Y,Mizano A.Lactosylceramide is essential for osteoclastogenesis mediated by macrophage-colony-stimulating factor and receptor act ivator of nuclear factor kB ligand.J Biol Chem.2001;276:46031-46038.

39.Gliki G,Wheeler-Jones C,Zachary I.Vascular endothelial growth factor induces protein kinase C (PKC)-dependent Akt/PKB activation and phosphatidylinositol 3’kinase-mediates PKC delta phosphorylation:role of PKC in angiogenesis.Cell Biol Int.2002;26:751-759.

40.Xia P,Aiello LP,Ishii H,Jiang ZY,Park DJ,Robinson GS,Takagi H,Newsome WP,Jirousek MR,King GL.Characterization of vascular endothelial growth factor’s effect on the activation of protein kinase C,its isoforms,and endothelial cell growth. J Clin Invest.1996;98:2018-2026.

太阳城集团41.Chae S,Paike JH,Furneaux H,Hla T.Requirement of sphingosine 1-phosphate receptor-1 in tumor angiogenesis demonstrated by in vivo RNA interference.J Clin Invest.2004; 114:1082-1089.

太阳城集团本文
本文标题:血管新生治疗方法.pdf
链接地址:http://zh228.com/p-7018706.html
太阳城集团我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
葡京赌场|welcome document.write ('');