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用于治疗癌症和与血管生成功能相联系的疾病的新化合物.pdf

关 键 词:
用于 治疗 癌症 血管 生成 功能 相联 疾病 化合物
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摘要
申请专利号:

CN200580044927.4

申请日:

20051101

公开号:

CN101090631A

公开日:

20071219

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01N43/58,A01N43/60,A01N43/54,A01N43/42,A01N43/30,A01N43/56,A01N43/38,A01N43/16,A01N37/18,A61K31/50,A61K31/495,A61K31/517,A61K31/505,A61K31/47,A61K31/425,A61K31/415,A61K31/40,A61K31/35,A61K31/16,C07D239/00,C07D239/70,C07D471/00,C07D487/00,C07D491/00,C07D241/36,C07D403/00,C07D413/00,C07D311/04,C07D311/74,C07D241/00,C07D249/00 主分类号: A01N43/58,A01N43/60,A01N43/54,A01N43/42,A01N43/30,A01N43/56,A01N43/38,A01N43/16,A01N37/18,A61K31/50,A61K31/495,A61K31/517,A61K31/505,A61K31/47,A61K31/425,A61K31/415,A61K31/40,A61K31/35,A61K31/16,C07D239/00,C07D239/70,C07D471/00,C07D487/00,C07D491/00,C07D241/36,C07D403/00,C07D413/00,C07D311/04,C07D311/74,C07D241/00,C07D249/00
申请人: 南加利福尼亚大学
发明人: N·尼马蒂,A·加鲁法洛
地址: 美国加利福尼亚
优先权: 60/624,253,11/027,465
专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 代理人: 唐晓峰
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法律状态
申请(专利)号:

CN200580044927.4

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团用于治疗癌症和与血管生成功能相联系的疾病的新颖化合物。还公开了制备化合物、含有这些化合物的药物组合物和包装产品的方法,使用这些分子治疗癌症(例如白血病、非小细胞性肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌和前列腺癌),以及与血管生成功能相联系的疾病(例如与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良和糖尿病)的方法,监测治疗的方法,构建基因表达谱的方法,和调节细胞生长、细胞周期、凋亡或基因表达的方法。

权利要求书

太阳城集团1.式I的化合物,式I其中X=CH或N;Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;R′=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类。2.式II的化合物,式II其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;和Y包括同素环或杂环,其中当R是H,R′是H,X是CH,和Y是吡嗪基或吡啶基时,Y是3-、5-或6-吡嗪基或3-、4-、5-或6-吡啶基。3.权利要求2的化合物,其中烷基是Me。4.权利要求2的化合物,其中卤素是F。5.权利要求2的化合物,其中Y是吡咯基、吡啶基、吡嗪基、氟苯基、喹_啉基或吡咯并-喹_啉基。6.权利要求2的化合物,其中R是H,R′是H,和X是CH;R是Me,R′是Me,和X是CH;R是F,R′是H,和X是CH;或R是H,R′是H,和X是N。7.权利要求6的化合物,其中Y是吡咯基、吡啶基、吡嗪基、氟苯基、喹_啉基或吡咯并-喹_啉基。8.权利要求7的化合物,其中化合物选自SC141、SC142、SC143、SC144、SC148、SC166、SC167、SC168、SC169、SC170、SC171、SC172、SC173和SC174。9.权利要求2的化合物,其中化合物是式III,式III其中R=o-Cl、p-Cl、p-F、p-CN、p-OMe或p-CF3。10.权利要求9的化合物,其中化合物是SC160、SC161、SC162、SC163、SC164或SC165。11.权利要求2的化合物,其中化合物是式IV,式IV其中R=3-NH,R=5-CF;R=5-NH,R=2-NO;R=4-NH,R=3-NO;R=2-NH,R=5-OH;R=4-NH,R=H;R=3-NH,R=H;或R=2-NH,R=H。12.式V的化合物,式V其中X=CH或N;Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类。13.权利要求12的化合物,其中化合物选自SC153、SC154、SC155、SC156、SC157和SC158。14.式VI的化合物,式VI其中Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类。15.权利要求14的化合物,其中化合物是SC175或SC176。16.式VII的化合物,式VII17.一种制备化合物的方法,包括:使肼一水合物与式VIII的化合物(13a、13b、13c或13d)接触,式VIII其中R是H,R′是H,和X是CH(13a);R是Me,R′是Me,和X是CH(13b);R是F,R′是H,和X是CH(13c);或R是H,R′是H,和X是N(13d),以形成式IX的化合物(分别为14a、14b、14c或14d),式IX其中R是H,R′是H,和X是CH(14a);R是Me,R′是Me,和X是CH(14b);R是F,R′是H,和X是CH(14c);或R是H,R′是H,和X是N(14d);和使14a与吡咯-2-羧酸氯化物接触而形成SC141,使14a与烟酰氯盐酸盐接触而形成SC142,在2,2′-二硫基联吡啶和三苯膦存在下,使14b、14c和14d与2-吡嗪羧酸接触分别形成SC143、SC144和SC148,在盐酸1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺(EDC)/4-(二甲氨基)吡啶(DMAP),然后在三氟乙酸(TFA)/苯甲醚的存在下,使14a与N-BOC-四氢噻唑-4-羧酸接触形成SC153,在EDC/DMAP,然后在TFA/苯甲醚存在下,使14a与N-BOC-β-丙氨酸接触形成SC154,在EDC/DMAP存在下,使14a与2-吲哚羧酸、5-吲哚羧酸、6-吲哚羧酸和3-吲哚羧酸接触分别形成SC155、SC156、SC157和SC158,在EDC/DMAP,随后在TFA和苯甲醚的存在下,使14a与Boc-3-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-氯苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-氰基苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-甲氧苯基)丙酸和Boc-3-氨基-3-(4-三氟甲基苯基)丙酸接触分别形成SC160、SC161、SC162、SC163、SC164和SC165,在EDC/DMAP,随后在TFA和苯甲醚的存在下,使14a与15a-g接触分别形成SC166、SC167、SC168、SC169、SC170、SC171和SC172,使14a与2-喹_啉羧酸、二氯甲烷、三苯膦和2,2′-二硫基联吡啶接触形成SC173,使14a与吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-羧酸、二氯甲烷、三苯膦和2,2′-二硫基联吡啶接触形成SC174。18.制备化合物的方法,包括使肼一水合物与式X的化合物接触式X形成化合物SC147。19.制备化合物的方法,包括使9-肼基-9H-吡咯并[1,2-a]吲哚和吡啶分别与烟酰氯盐酸盐和吡嗪-2-碳酰氯接触形成SC175和SC176。20.治疗患者的方法,包括:鉴别患有或有发生非小细胞肺癌、CNS癌、卵巢癌、乳癌、肾癌、前列腺癌、与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良或糖尿病的危险的患者;和给患者施用有效量式XI或XII的化合物,式XI                                             式XII其中Ar包含芳环和Het包含杂环。21.一种治疗患者的方法,包括:鉴别患有或有发生癌症或与血管生成功能相联系的疾病的危险的患者;和给患者施用有效量式II的化合物,式II其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;和Y包含同素环或杂环。22.一种治疗患者的方法,包括给需要的患者施用有效量的权利要求1、2、8、9、10、11、12、13、14、15或16的化合物。23.权利要求22的方法,其中患者患有或有发生癌症或与血管生成功能相联系的疾病的危险。24.权利要求21或23的方法,其中癌症是白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌或前列腺癌;和与血管生成功能相联系的疾病是与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良和糖尿病。25.一种监测患者治疗的方法,包括:给具有癌细胞或与血管生成疾病相联系的细胞的患者施用权利要求1、12、14或16的化合物,或式II、XI或XII的化合物,式II其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;和Y包含同素环或杂环;式XI                                             XII其中Ar包含芳环和Het包含杂环;和使用PET成像技术监测细胞的存活、细胞的生长或其组合。26.权利要求25的方法,其中患者患有白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌、前列腺癌、与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良或糖尿病。27.式1-19的任一化合物,每个R1、R2和R3是氢原子、卤素、羟基、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基或含有1-20个碳原子的直链、支链或环状结构形式的有机基团。28.权利要求27的化合物,其中取代烷基、取代烯基、取代苯基、取代芳基,或取代杂芳基包含卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、苯氧基、芳氧基、氰基、异氰基、羰基、羧基、氨基、酰氨基、磺酰基,或取代杂环、糖、或肽取代,其中有机基团包括杂原子氧、硫或氮。29.选自SC20-37、SC201-266、SC268和SC270-280的化合物。30.一种调节细胞生长、细胞周期或凋亡的方法,包括使细胞接触权利要求27或29的化合物,由此抑制细胞生长、阻滞细胞周期或诱发凋亡。31.权利要求30的方法,其中细胞是白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌或前列腺癌细胞。32.一种调节细胞中基因表达的方法,包括使细胞接触权利要求27或29的化合物,由此增加或减少细胞中一种或多种基因的表达。33.权利要求32的方法,其中一种或多种基因选自BCL2、BCL2L1、JUN、JUNB、MAD、MAX、TNFRSF1A、TP53、NFKB1、TNFSF10、CASP1、PCNA、TNFAIP1、DAP、KDR、MAP3K14、CCNA2、CDC2、CDK7、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2C、E2F1、E2F4、E2F5、MYC、RB1、RBL2、CCND3、CCNG1、CCNE1、CDC25C、TGFBR2、TGIF、TRAF4、CYP1A2、PTGS2、p21、p27、细胞周期蛋白A、cdk1、p53、细胞周期蛋白E、cdc25、p130、NFKB、c-MYC、COX2、Bcl-XL、膜联蛋白V、caspase 1、TNF受体、微管结合蛋白4、微管亲合力调节激酶2、微管亲合力调节激酶4、ERBB2转导子、血管内皮生长因子B、血管内皮生长因子、锚蛋白重复序列和MYND域1、RAB4B、假定前列腺癌肿瘤抑制子、前B细胞白血病转录因子2、T-细胞白血病易位改变基因、白血病抑制因子、干扰素调节因子2结合蛋白、干扰素刺激基因(20kDa)、干扰素γ受体2、28kD干扰素应答蛋白、聚合酶(RNA)III、过氧化物酶增值子活性受体A相互作用复合物285、RAD50同系物(S.cerevisiae)、MAX二聚蛋白3、kruppel样因子16、载脂蛋白L(6)、X射线修复互补缺陷修复、细胞分裂素活化蛋白激酶3、磷脂酰肌醇4-激酶II型、细胞分裂素活化蛋白激酶12、蛋白激酶(AMP-活化,α2催化亚型)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶调节亚型、磷脂酶D3、肌醇1,4,5-三磷酸酯受体(3型)、维甲酸受体(α)、肿瘤坏死因子受体超家族、烯醇化酶2(γ,神经元)、stanniocalcin 2、apelin、plexin B2、组织蛋白酶Z、组蛋白1(H2bc)、组蛋白1(H3h)、β-微管蛋白、myc启动子结合蛋白(MPB-1)、视网膜母细胞瘤结合蛋白7、波形蛋白、烯醇化酶、磷酸丙酮酸水合酶β,线粒体ATP合酶β链。34.一种治疗患者的方法,包括给需要的患者施用的有效量的权利要求27或29的化合物。35.权利要求34的方法,其中患者患有或有发生癌症的危险。36.权利要求35的方法,其中癌症是白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌或前列腺癌。37.一种药物组合物,其包括有效量的一种或多种权利要求27或29的化合物和药学可接受的载体。

说明书

用于治疗癌症和与血管生成功能相联系的疾病的新化合物

相关申请

太阳城集团本申请是2004年12月29日提交的未决在先美国专利申请序列号 第11/027,465的部分继续申请。本申请还要求2004年11月1日提交 的美国临时申请序列号第60/624,253的优先权。将美国专利申请序列 号第11/027,465和美国临时申请序列号第60/624,253的内容引入本 文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于治疗癌症和与血管生成功能相联系的疾病的治疗 化合物。更具体地,本发明涉及新化合物及其用于治疗癌症例如白血 病、非小细胞性肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、 肾癌和前列腺癌,以及与血管生成功能相联系的疾病例如与年龄相关 的黄斑变性、黄斑营养不良和糖尿病的用途。

发明背景

传统上大多数抗癌药物是通过作为终点测试的高通量细胞毒性筛 选而发现的(Neamati和Barchi Jr.(2002)Curr.Top.Med. Chem.2:211-227)。一般而言,即使不是这些药物的全部,大多数药 物均具有多种作用机理和多种耐受机理。除极少数例外,它们作用机 理的鉴别要远远晚于它们的发现。发现了某些药物的实际作用机理与 它们最初预料的机理不同。尽管使用了多种策略鉴别药物靶点,但是 人们逐渐意识到使用当前的技术没有容易和直接的鉴别方法。提出了 两种原因来解释该现象。第一与小分子药物的固有性质(例如,许多 细胞类型的膜通透性),加上其与例如抗体-抗原识别相比缺少选择 性和特异性有关。第二,由于大量的序列和结构同源性,过多的冗余 成为作为靶点的生物学系统的组成部分。这可以解释为什么在许多情 况中“杂乱的抗癌药”作用与靶向治疗药物一样或仅仅略好。无论什 么机理,在任何药物研发计划中初始和关键步骤是先导鉴别。

在超过100种FDA批准的抗癌药物中,广泛使用的不超过20种。 相反地,在各种组合中使用了全部19种FDA批准用于HIV-1感染的药 物。尽管抗病毒药几乎经常口服施用,但是很少有抗癌药口服有效。 因此,需要大多数未来的靶向治疗剂口服有效。

太阳城集团迫切需要利用我们增加的肿瘤生物学理解来开发高活性、耐受良 好性和容易使用(理想地口服有效)的药物。然而,在药物发现计划 中需要克服的一个主要障碍是鉴别具有所需生物活性的适合的先导化 合物。只有不到1%的试验化合物将被最终选择做进一步的研究。在 药物开发过程中药物动力学和药效学特性的临床前评估和药物代谢知 识是重要的。选择候选药物做进一步研究后,需要体外筛选以及动物 模型的体内功效和毒性评估的详细太阳城集团来预测所选化合物在人类中的 体内结果。传统的药物动力学研究,尽管是必需的,但是麻烦并且费 时,还需要大量的动物。近来在计算机模拟中的技术进步使得可对吸 收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET)进行预测,成为一种可靠和快 速的方法,减少了评估候选药物治疗潜力所需的太阳城集团和资源(Neamati 和Barchi Jr.(2002)Curr.Top.Med.Chem.2:211-227)。

以前,我们证明了由于缺少对整合酶的选择性,我们的某些HIV-1 整合酶抑制剂表现出显著的细胞毒性(Hong等(1997)J.Med.Chem. 40:930-6,Zhao等(1997)J.Med.Chem.40:937-41,Neamati等(1998) J.Med.Chem.41:3202-9,和Neamati等(2002)J.Med.Chem. 45:5661-70)。事实上,在逆转录病毒整合酶和拓扑异构酶之间的相 似性促使进行评估拓扑异构酶I和II对整合酶毒性的第一项研究 (Fesen等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2399-403)。因 此,我们常规地将拓扑异构酶作为整合酶抑制剂的计数筛选(Neamati 等(1998)J.Med.Chem.41:3202-9;Neamati等(2002)J.Med.Chem. 45:5661-70;Neamati等(1997)In Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology,Santa Fe.Keystone Symposia,p.32; Neamati等(1997)Mol.Pharmacol.52:1041-55;和Neamati等(1997) J.Med.Chem.40:942-51)。在更近一些的研究中,我们证明了到目 前为止所鉴别的大多数选择性的整合酶抑制剂也会抑制VDJ重组必需 的RAG1/2酶(Melek等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:134-7)。 所有这些酶共有相似的DNA键合、DNA裂解和需要二价金属(Mn2+和Mg2+但不是Ca2+;Neamati等(2000)Adv.Pharmacol.49:147-65)的重 组的化学性质。由于整合酶属于聚核苷酸转移酶大家族(Rice等(1996) Curr.Opin.Struct.Biol.6:76-83),看起来似乎可能的是我们 某些抑制剂能靶向未知的DNA处理酶。

发明概述

本发明基于,至少部分基于意外的发现,即以下描述的新化合物 能用于治疗癌症和与血管生成功能相联系的疾病。

太阳城集团因此,一方面,本发明描述了式I的化合物,

式I

太阳城集团其中X=CH或N;Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或 N-烷基;和R′=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和Y=烷基、 杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类。

太阳城集团另一方面,本发明描述了式II的化合物,

式II

其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;Y 包含同素环或杂环,其中当R是H,R′是H,X是CH和Y是吡嗪基或 吡啶基时,Y是3-、5-或6-吡嗪基或3-、4-、5-或6-吡啶基。

太阳城集团例如,烷基可以是Me,卤素可以是F,Y可以是吡咯基、吡啶基、 吡嗪基、氟苯基、喹_啉基或吡咯并-喹_啉基。更具体地,在一个实 施方案中,R是H,R′是H,和X是CH;在另一个实施方案中R是Me, R′是Me,和X是CH;仍然在另一个实施方案中,R是F,R′是H,和X 是CH;仍然在另一个实施方案中,R是H,R′是H,和X是N。所述化 合物的例子包括SC141-144、SC148和SC166-174。

太阳城集团在一个实施方案中,化合物是式III,

                          式III

其中R=o-Cl、p-Cl、p-F、p-CN、p-OMe或p-CF3。所述化合物 的例子包括SC160-165。

太阳城集团在另一实施方案中,化合物是式IV,

式IV

太阳城集团其中R1=3-NH2,R2=5-CF3;R1=5-NH2,R2=2-NO2;R1=4-NH2,R2=3-NO2;R1=2-NH2,R2=5-OH;R1=4-NH2,R2=H;R1=3-NH2,R2=H; 或R1=2-NH2,R2=H。

太阳城集团本发明还描述了式V的化合物,

式V

其中X=CH或N;Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或 N-烷基;和Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类。所述化合物 的例子包括SC153-158。

本发明的另一个化合物是式VI,

式VI

太阳城集团其中Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和 Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类。所述化合物的例子包括 SC175-176。

太阳城集团而且,式VII的化合物也在本发明内:

式VII

SC147

太阳城集团而且,本发明描述了任一式1-19的化合物,

其中每个R1、R2和R3是氢、卤素、羟基、烷基、取代烷基、烯 基、取代烯基、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂 芳基,或含有1-20个碳原子的直链、支链或环状结构形式的有机基团。 取代烷基、取代烯基、取代苯基、取代芳基或取代杂芳基可包含卤素、 羟基、烷氧基、烷硫基、苯氧基、芳氧基、氰基、异氰基、羰基、羧 基、氨基、酰氨基、磺酰基,或取代杂环、糖、或肽取代。有机基团 也包括氧、硫、氮的杂原子。

所述化合物的具体例子包括SC20-37、SC201-266、SC268和 SC270-280。SC20-37、SC201-266、SC268和SC270-280的结构如下所 示。

本发明提供了制备本发明化合物的方法。例如,化合物 SC141-144、SC148、SC153-158和SC160-174如下制备:首先,使肼 一水合物与式VIII的化合物(13a、13b、13c或13d)接触,

式VIII

其中R是H,R′是H,和X是CH(13a);R是Me,R′是Me,和X 是CH(13b);R是F,R′是H,和X是CH(13c);或R是H,R′是H, 和X是N(13d),以形成式IX的化合物(分别为14a、14b、14c或14d),

式IX

太阳城集团其中R是H,R′是H,和X是CH(14a);R是Me,R′是Me,和X 是CH(14b);R是F,R′是H,和X是CH(14c);或R是H,R′是H, 和X是N(14d)。然后通过使14a与吡咯-2-羧酸氯化物接触而形成 SC141;通过使14a与烟酰氯盐酸盐接触形成SC142;在2,2′-二硫基 联吡啶和三苯膦存在下,通过使14b、14c和14d与2-吡嗪羧酸接触 分别形成SC143、SC144和SC148;在盐酸1-[3-(二甲氨基)丙基]-3- 乙基碳化二亚胺(EDC)/4-(二甲氨基)吡啶(DMAP),然后在三氟乙酸 (TFA)/苯甲醚的存在下,通过使14a与N-BOC-四氢噻唑-4-羧酸接触 形成SC153;在EDC/DMAP,然后在TFA/苯甲醚存在下,通过使14a与 N-BOC-β-丙氨酸接触形成SC154;在EDC/DMAP存在下,通过使14a 与2-吲哚羧酸、5-吲哚羧酸、6-吲哚羧酸和3-吲哚羧酸接触分别形成 SC155、SC156、SC157和SC158;在EDC/DMAP,随后在TFA和苯甲醚 的存在下,通过使14a与Boc-3-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸、Boc-3-氨 基-3-(4-氯苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸、Boc-3-氨基 -3-(4-氰基苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-甲氧苯基)丙酸和Boc-3-氨 基-3-(4-三氟甲基苯基)丙酸接触分别形成SC160、SC161、SC162、 SC163、SC164和SC165;在EDC/DMAP,随后在TFA和苯甲醚的存在下, 通过使14a与15a-g(15a:2-氟苯甲酸,15b:2-氟-4-羟基苯甲酸, 15c:3-氟苯甲酸,15d:3-氟-4-(三氟甲基)苯甲酸,15e:4-氟苯甲 酸,15f:4-氟-2-羟基苯甲酸,15g:3-氟-5-硝基苯甲酸)接触分别形 成SC166、SC167、SC168、SC169、SC170、SC171和SC172。通过使 14a与2-喹_啉羧酸、二氯甲烷、三苯膦和2,2′-二硫基联吡啶 (dipyridyl disulfide)接触形成SC173;通过使14a与吡咯并[1,2- a]喹_啉-4-羧酸、二氯甲烷、三苯膦和2,2′-二硫基联吡啶接触形 成SC174。

通过使肼一水合物与式X的化合物接触制备化合物SC147。

式X

通过使烟酰氯盐酸盐与9-肼基-9H-吡咯并[1,2-a]吲哚和吡啶 接触制备化合物SC175。通过使盐酸吡嗪-2-碳酰氯与9-肼基-9H-吡咯 并[1,2-a]吲哚和吡嗪接触制备化合物SC176。

本发明进一步提供了一种药学组合物,其含有有效量的一种或多 种本发明的化合物和药物可接受的载体。该组合物可进一步含有有效 量的一种或多种用于治疗癌症或与血管生成功能相联系疾病的其他药 物,例如紫杉醇、阿霉素或5-FU。

太阳城集团本发明还描述了一种包装产品,其包括容器;有效量的式XI或 XII化合物,

式XI                     式XII

太阳城集团其中Ar包含芳香环和Het包含杂环;与容器相关的说明书,说明 施用该化合物以治疗非小细胞肺癌、CNS癌、卵巢癌、乳癌、肾癌和 前列腺癌、与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良或糖尿病。

太阳城集团而且,本发明提供一种包装产品,其包括容器;有效量的式II 的化合物,

式II

其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;和 Y含有同素环或杂环;和与容器相关的说明书,说明书施用该化合物 以治疗癌症或与血管生成功能相联系的疾病。

太阳城集团其他包装产品,其包括容器;有效量的本发明化合物;和与容器 相关的说明书,说明施用化合物以治疗癌症或与血管生成功能相联系 病症。

太阳城集团本发明的产品可进一步包括有效量的一种或多种用于治疗癌症或 与血管生成功能相联系疾病的其他药物,例如,紫杉醇、阿霉素或 5-FU。

太阳城集团癌症的例子包括白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色 素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌和前列腺癌;与血管生成功能相联系的疾 病的例子包括与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良和糖尿病。

通过给需要该化合物的患者施用有效量的上述化合物治疗患者的 方法也属于本发明的范围。该患者可被确定为患有或具有发生癌症或 与血管生成功能相联系的疾病的风险。特别地,癌症可以是白血病、 非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌或 前列腺癌;与血管生成功能相联系的疾病可以是与年龄相关的黄斑变 性、黄斑营养不良或糖尿病。本方法可进一步包括给患者施用有效量 的一种或多种用于治疗癌症或与血管生成功能相联系病的疾病的其他 药物,例如紫杉醇,阿霉素或5-FU。该化合物与一种或多种其他药物 可同时给药或顺序施用。

而且,本发明描述了一种通过给具有癌症细胞或与血管生长功能 疾病相关的细胞的患者施用上述化合物,并使用PET成像技术测定细 胞存活、细胞生长或其联合的监测患者治疗的方法。患者可以患有白 血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、 肾癌、前列腺癌、与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良或糖尿病。 患者可以是动物,例如,鼠,细胞可以是异种移植的人类细胞。在一 个实施方案中,患者是人类。

太阳城集团此外,本发明提供了一种构建基因表达谱的方法。该方法包括使 测试细胞与上述化合物接触,并在测试细胞中构建基因表达谱。测试 细胞可以是癌症细胞或与血管生成功能疾病相关的细胞。更具体地是, 测试细胞可以是白血病细胞、非小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞、CNS 癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、乳癌细胞、肾癌细胞、前列腺 癌细胞,或与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良或糖尿病有关的细 胞。该方法可进一步包含比较测试细胞和对照细胞的基因表达,对照 细胞可与具有已知作用或耐受用于接触测试细胞的化合物的其他化合 物接触。

本发明还提供一种调节细胞中基因表达的方法。该方法包括使细 胞细胞与上述化合物接触,由此调节(增加或减少)细胞中一种或多 种基因的表达。细胞可以是癌症细胞或与血管生长功能疾病相关的细 胞。具体是,细胞可以是白血病细胞、非小细胞肺癌细胞、结肠癌细 胞、CNS癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、乳癌细胞、肾癌细胞、 前列腺癌细胞,或与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养不良或糖尿病有 关的细胞。一种或多种基因的例子包括小分子富脯氨酸蛋白1A;在骨 骼肌中过量表达的GTP结合蛋白;白细胞介素24;sestrin 2;假定 蛋白MGC4504;细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21);早期 生长应答1;ATP酶、H+转运、溶酶体38kDa、V0亚型d同工型 (isoform)2;AXIN1向上调节1;双重特异性磷酸酶5;超氧化歧 化酶2、线粒体;肝素结合表皮生长因子样生长因子;A分解蛋白和金 属蛋白酶域19(融合素β);内皮PAS域蛋白1;肌醇1,4,5-三磷酸 酯受体,1型;组织因子通道抑制剂(脂蛋白结合的凝固抑制剂); 纤维蛋白原、γ多肽;RAB20、RAS致癌基因族成员;蛋白激酶、AMP- 活性,γ2非催化亚单位;制瘤素M受体;组织蛋白酶B;B细胞抑 制剂中的核素κ轻多肽基因增强子的核因子,α;BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3;整联蛋白,β3(血小板糖蛋白IIIa,抗原 CD61);双重特异性磷酸酶10;细胞周期调节蛋白SDP35;plexin C1; 小眼球结合转录因子;钙激活蛋白酶小亚型2;假定蛋白 DKFZp434L142;MEGF 10蛋白;EphA2;jagged1(Alagille综合征); hemicentin;低密度脂蛋白受体(肝素结合表皮生长因子样生长因 子);酪氨酸酶相关蛋白1;酪氨酸酶(眼皮肤白化病IA);多巴色 素互变异构酶(多巴色素δ-异构酶、酪氨酸相关蛋白2);层粘连蛋 白,β3;MAX二聚蛋白1;CDK4-结合蛋白p34SEI1;人类cDNA FLJ42435fis,克隆BLADE2006849;生长停止和DNA-损伤-诱导,β; 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂2B(p15,抑制CDK4);白喉毒 素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子);突触融合蛋白结合蛋 白6(amisyn);转运分泌蛋白2.2;Arg/Abl相互作用蛋白ArgBP2;假 定蛋白DJ667H12.2;人cDNA FLJ37284fis、克隆RAMY2013590;BCL2、 BCL2L1、JUN、JUNB、MAD、MAX、TNFRSF1A、TP53、NFKB1、TNFSF10、 CASP1、PCNA、TNFAIP1、DAP、KDR、MAP3K14、CCNA2、CDC2、CDK7、 CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2C、E2F1、E2F4、E2F5、MYC、 RB1、RBL2、CCND3、CCNG1、CCNE1、CDC25C、TGFBR2、TGIF、TRAF4、 CYP1A2、PTGS2、(p21)、p27、细胞周期蛋白A、cdk1、p53、细胞周 期蛋白E、cdc25、p130、NFKB、c-MYC、COX2、Bcl-XL、膜联蛋白V (annexin V)、caspase 1、TNF受体、微管结合蛋白4、微管亲合 力调节激酶2、微管亲合力调节激酶4、ERBB2转导子、血管内皮生长 因子B、血管内皮生长因子、锚蛋白重复序列和含MYND域1、RAB4B、 假定前列腺癌肿瘤抑制基因、前B细胞白血病转录因子2、T-细胞白 血病易位改变基因、白血病抑制因子、干扰素调节因子2结合蛋白、 干扰素刺激基因(20kDa)、干扰素γ受体2、28kD干扰素应答蛋白、聚 合酶(RNA)III、过氧化物酶增值子活性受体A相互作用复合物285、 RAD50同系物(S.cerevisiae)、MAX二聚蛋白3、kruppel样因子16、 载脂蛋白L(6)、X射线修复互补缺陷修复、细胞分裂素活化蛋白激酶 3、磷脂酰肌醇4-激酶II型、细胞分裂素活化蛋白激酶12、蛋白激酶 (AMP-活化,α2催化亚型)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶调节亚型、磷脂 酶D3、肌醇1,4,5-三磷酸酯受体(3型)、维甲酸受体(α)、肿瘤坏 死因子受体超家族、烯醇化酶2(γ,神经元)、stanniocalcin 2、 apelin、plexin B2、组织蛋白酶Z、组蛋白1(H2bc)、组蛋白1(H3h)、 β-微管蛋白、myc启动子结合蛋白(MPB-1)、视网膜母细胞瘤结合 蛋白7、波形蛋白、烯醇化酶、磷酸丙酮酸水合酶β,和线粒体ATP 合酶β链。

本发明进一步提供一种调节细胞生长、细胞周期或凋亡的方法。 该方法包括使细胞与权利要求1或3的化合物接触,由此抑制细胞生 长、阻滞细胞周期或诱发凋亡。细胞的例子包括白血病、非小细胞肺 癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌或前列腺癌细 胞。

通过参考以下描述,包括结合附加的附图,本发明上述特征和其 他特征以及获得方式及其使用方法将变得更为明显,并可被最好地理 解。附图仅仅描述本发明典型的实施方案,因此并不限制其范围。

附图简述

太阳城集团图1说明了使用SC144处理的MDA-MB-435细胞的细胞周期特性的 流式细胞分析。细胞暴露在SC144中16小时、24小时和48小时,用 碘化丙啶进行染色(PI)并分析对细胞周期的干扰。

太阳城集团图2说明了用SC144和CPT(IC80)处理的MDA-MB-435细胞的凋亡 分析。细胞用膜联蛋白V/PI染色并通过流式细胞仪进行分析。在每个 盘左下象限的细胞(膜联蛋白V-阴性,PI-阴性)是存活的,然而在 右下象限的细胞(膜联蛋白V-阳性,PI-阴性)处于凋亡的早期阶段, 在右上象限(膜联蛋白V-阳性,PI-阳性)的细胞处于凋亡和坏死的 后期阶段。

太阳城集团图3(A)是异种移植模型中肿瘤生长和给药的简图。每天用规定 剂量的SC144通过i.p.使用5天对植入MDA-MB-435细胞的无胸腺裸 小鼠进行处理。(B)说明了以0.3、0.8和4mg/kg的剂量SC144减少 人类乳癌异种抑制物的大小。肿瘤生长监测5周。数值表示每组的平 均肿瘤重量。(C)显示了在试验最后一天计算的每个治疗组的%T/C (bars±SD)。

图4(A)显示了SC144治疗的小鼠的代表性图象。(B)显示了 SC144(4mg/kg)治疗的小鼠与对照的肿瘤大小的比较。(C)显示了 盘B中显示的从小鼠切割的肿瘤。

图5表明SC144诱发肿瘤组织显著的坏死。在第70天制备未治疗 肿瘤组织(A)和SC144治疗组织(B)的H&E染色。一般而言,在治 疗的肿瘤(盘B的左侧)可以观察到80%以上的坏死,非坏死细胞(盘 B的右侧)处于凋亡的早期阶段。

太阳城集团图6表明SC144不呈现器官毒性。SC144治疗的肾组织(A)、肝 组织(B)和心脏组织(C)的H&E染色显示正常的模式。

太阳城集团图7说明酮康唑、SC144及其类似物SC24对人类CYP3A4的抑制。 通过在37℃,在96孔板进行温育来评价通过人类cDNA-表达的CYP3A4 的荧光底物的代谢。通过测量相应的7-羟基-4-三氟-甲基香豆素的产 量来分析7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素(BFC)的代谢。

太阳城集团图8显示了植入人类乳癌(MDA-MB-435)细胞的裸小鼠的PET成 像(片厚度0.6mm)。顶行,基线扫描:(A)平衡相FDG,注射后30 分钟;(B)FMAU,注射后10分钟;(C)FMAU,注射后60分钟。底 端行,继续扫描:(D)FDG,注射后30分钟;(E)FMAU,注射后10 分钟;(F)FMAU,注射后60分钟。在连续几天用FDG和FMAU(基线) 对小鼠成像,然后通过每天i.p.注射4mg/kg的SC144进行治疗。给 药5天后,中止药物治疗并在第6和7天获得继续扫描。

图9说明了两个独立试验中基因表达谱的比较。(A)未处理对照 样品D565相对D566的散布图和(B)SC144治疗的对D571和D572芯 片。(C)t-统计(x-轴)曲线,表示显著性水平,相对于SC144处理 的细胞与未处理的对照中log平均表达差异(表示折叠变化)。

图10说明了SC144显示出不同于其他类化合物的独特活性形态。 (A)所有14个观察的基因的三主成分分析(B)通过GenetrixTM产生 的谱系聚类分析。

太阳城集团图11显示了使用GenetrixTM工具通过分子功能的基因生物太阳城集团学 分析。

图12显示了由GenetrixTM中提供的InterPro分类工具衍生的基 因列表。

图13显示了经鉴别的SC144和鬼臼乙叉甙的共同基因的亚类。

图14显示SC144、米托蒽醌和喜树碱的共同基因的亚类。

图15说明了药物吸收的预测。将每种化合物的快极性表面积埃2对其相应的计算分配系数作图。椭圆包围的区域是对没有违背ADMET 特性的良好吸收的预测。以Egan等((2000)J.Med.Chem. 43:3867-77)的吸收模型为基础,外部的椭圆代表99%的置信度,内 部椭圆代表95%的置信度。

图16显示了SC21和CPT对DU145细胞抑制的太阳城集团-(A)和浓度 依赖(B)。

太阳城集团图17描述了SC21处理的DU145、PC3、MDA-MB-435和HEY细胞的 细胞周期特性的流式细胞术分析。细胞暴露在SC21(IC50)中24小时、 48小时和72小时,然后获收集细胞,用碘化丙啶进行染色并分析对 细胞周期的干扰。SC21诱发DU145和MDA-MB-435细胞的G0/G1期阻 滞,诱发PC3和HEY细胞的S期阻滞。第24h测量显示的对照细胞, 如所预期,在第48小时和第72小时在对照细胞中没有观察到显著变 化。

图18显示了通过使用流式细胞仪测量sub-G0/G1群体数计算凋亡 百分数。在用SC21和CPT处理的PC3和DU145中凋亡细胞群体数随时 间增加。

图19说明了SC21或CPT(IC80)处理的DU145细胞的凋亡分析。 细胞用SC21或CPT处理24、48和72小时,收集,用膜联蛋白V/碘 化丙啶DNA染色并通过流式细胞仪分析。未处理的对照细胞(第24 和48小时)也包括在分析中。在FL1-H或red channel中记录膜联蛋 白VFITC信号,在FL2-H或green channel中记录碘化丙啶。在左下 象限的细胞(膜联蛋白V-阴性,碘化丙啶DNA染色法-阴性)是存活 的,然而在右下象限的细胞(膜联蛋白V-阳性,碘化丙啶DNA染色法 -阴性)是处于凋亡的早期阶段,在右上象限的细胞(膜联蛋白V-阳 性,碘化丙啶DNA染色法-阳性)是处于凋亡和坏死的后期阶段。

太阳城集团图20(A)PC3异种移植小鼠中肿瘤生长和给药的简图。(B)显 示了SC21减少人类前列腺癌异种移植物的大小。用规定浓度的SC21 通过每天i.p.施用5天,对植入PC3细胞的无胸腺裸小鼠进行治疗。 监测肿瘤生长5周。数值表示每组的肿瘤重量(平均值±SD)。(C) 描述了PC3异种移植中SC21的剂量反应。数值表示在测量的最后一天 (5周后)每一治疗组的%T/C;bars,±SD。与对照组相比以两种剂 量用SC21治疗显著的减少肿瘤生长(%T/C V50%)。

图21说明了RT-PCR基因表达分析。由T24细胞分离总RNA,并 用2.5μg总RNA合成cDNA。用GENE系统I基因表达试剂盒(Gene Express Inc)进行标准的RT-PCR。每个试剂盒含有内部竞争模板和相 应引物的混合物。

图22显示了SC23诱发的选自表8的针对106分子β-肌动蛋白标 准化的基因表达(分子数)。在暴露于SC233、6、12、24和48小时 后由T24细胞分离总RNA。

太阳城集团图23是细胞周期(左)和凋亡(右)所包括的途径的图示。

图24是两个独立试验中基因表达谱比较的代表性实例。(A)未 处理的对照样品D565相对于D566芯片的散布图,(B)鬼臼乙叉甙处 理的配对的D720和D721芯片,和(C)米托蒽醌处理的配对的D724 和D725芯片。

图25说明了SC23显示与紫杉醇最为相似的活性模式。(A)一系 列比较使用5FU、CPT、鬼臼乙叉甙、紫杉醇和米托蒽醌处理与使用SC23 处理的基因表达(去除所有噪音和低表达后,18,000个基因)的散布 图。(B)对与盘A相同但仅是通过至少5次倍变化而改变的基因进行 绘图。

太阳城集团图26是显示三种化合物中重叠的基因数量的Venn图。该图由总 计878个基因产生,其对SC23、5-FU和紫杉醇治疗的响应在5次折叠 改变以上。

太阳城集团图27说明了SC23显示与紫杉醇最为相似的活性模式。(A)对于 全部10次观察的基因的三主成分分析。(B)通过GenetrixTM产生的 分级聚类分析。

太阳城集团图28描述SC23诱发的的蛋白质表达的改变。T24细胞用IC50(第 2泳道)和IC80(第3泳道)剂量的SC23处理72小时。第1泳道:未 处理的细胞对照。

太阳城集团图29显示了SC23处理的T24细胞的二维凝胶电泳。细胞用SC23 (IC80剂量)处理12、24、48和72小时。然后提取可溶成分并定量。 以800V将50mg蛋白质装载于第一维凝胶16小时。然后平衡凝胶,在 用于第二维的12%SDS-PAGE凝胶,用CyproRuby染色,并通过Typhoon 9100成像。

太阳城集团图30说明了由2D凝胶(左)所选择的SC23处理的细胞区域和使 用PDQuest对斑点定量。

太阳城集团图31显示了β-微管蛋白肽(EVDEQMLNVQNK)和myc启动子-结合 蛋白(MPB-1)肽(VNQIGSVTESLQACK)的MS/MS谱。

发明详述

基于三维抗肿瘤结构模型(特异性抑制DNA处理酶)并与预测性 药物代谢动力学(PK)模拟相结合设计了一系列化合物。若干化合物 对一组人类癌细胞株显示出显著的细胞毒性模式。测试了一系列200 个化合物对若干耐药癌细胞株的作用。根据效力和药物类似性质,选 择SC144作为先导分子。该化合物对乳癌异种移植的裸小鼠呈现出体 内有效性而无明显毒性。该化合物的活性不依赖激素受体(HR)、p53、 pRb、p21或p16的状态。而且,在耐受顺铂的卵巢癌细胞株(HEY) 中SC144在S期阻断细胞并诱发凋亡,活性与喜树碱相当。考虑到该 化合物在多种体外模型中表现出的细胞毒性特性,SC144似乎代表了 一种新的并有希望治疗癌症和与血管生成功能相联系的疾病的候选药 物。

太阳城集团我们还评估了SC21和SC23对一定范围的人肿瘤细胞类型的体外 活性,以及化合物SC21在鼠PC3人前列腺癌异种移植模型的体内有效 性。我们测定了SC21在细胞周期调节和凋亡中的效果。我们体外结果 显示水杨酰肼是在激素受体阳性和阴性癌细胞中高度有效的化合物。 SC21诱发凋亡并将在G0/G1或S期阻断细胞周期,这取决于所使用的 细胞株而与p53、p21、pRb和p16状态无关。SC21有效的降低小鼠中 肿瘤的生长而无明显毒性。尽管SC21的作用机制尚未完全阐明,其对 细胞周期的作用、诱导凋亡和对一组不同来源的癌细胞株的活性促使 我们对SC21进行深入的临床前评估。这些化合物潜在地可用于治疗癌 症。

化合物

本发明的化合物具有以下结构式之一:

式I

其中X=CH或N;Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或 N-烷基;R′=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和Y=烷基、 杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类;

式II

太阳城集团其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;和 Y包含同素环或杂环,其中当R是H,R′是H,X是CH和Y是吡嗪基或 吡啶基时,Y是3-、5-或6-吡嗪基或3-、4-、5-或6-吡啶基。

式III

其中R=o-Cl、p-Cl、p-F、p-CN、p-OMe或p-CF3;

式IV

其中R1=3-NH2,R2=5-CF3;R1=5-NH2,R2=2-NO2;R1=4-NH2,R2=3-NO2;R1=2-NH2,R2=5-OH;R1=4-NH2,R2=H;R1=3-NH2,R2=H; 或R1=2-NH2,R2=H。

式V

太阳城集团其中X=CH或N;Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或 N-烷基;和Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类;

式VI

太阳城集团其中Z=O或S;R=烷基、卤素、乙酰基、O-烷基或N-烷基;和 Y=烷基、杂环芳香族、脂肪族、糖或脂类;或

式VII

每个R1、R2和R3,独立地或共同地是氢原子、卤素原子、羟基, 或任何其他含有任意数量的碳原子,优选1-20个碳原子和任选地包 括杂原子例如氧、硫或氮的直链、支链或环状结构形式的有机基团。 代表性的R1、R2和R3基团包括但不限于烷基、取代烷基、烯基、取 代烯基、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基。 代表性的取代基包括但不限于卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、苯氧基、 芳氧基、氰基、异氰基、羰基、羧基、氨基、酰氨基、磺酰基,和取 代杂环、糖或肽。

太阳城集团“同素环”指相同原子尤其是碳原子的封闭环;“杂环”指至少 一种原子不是碳原子的封闭环。“芳香”基团含有一个或多个苯环。 糖指单、双和三糖,脂类指具有或不具有亲水首基的长链脂肪族化合 物。

太阳城集团本发明的化合物可包括取代的和未取代的部分。术语“取代的” 指具有一个、两个、三个或更多取代基的部分,取代基可以相同或不 同的,分别取代氢原子。取代基的实例包括但不限于,烷基、羟基、 保护的羟基、氨基、保护的氨基、羧基、保护的羧基、氰基、烷氧基 和硝基。术语“未取代的”指具有每个原子被氢化以至于其每个原子 的化合价是满的部分。反应性部分被“保护”,指其是暂时的并可被 化学转化,以使其在未被保护部分反应的条件下不发生反应。例如, 三甲硅烷基化作用是用于保护反应性功能基团例如羟基或氨基免于在 阴离子聚合与中成长的阴离子反应的典型转换。

太阳城集团化合物的保护形式包括在本发明的范围内。一般而言,保护基的 种类不是关键,条件是其对随后在该化合物其它位置反应的条件稳定 并能在适当的点被去除而不会对该分子的剩余部分有不利影响。另外, 当实体合成转换完成后一个保护基可被另一个取代。各种保护基结合 和去除的实例和条件可在Greene,Protective Groups in Organic Chemistry,第1版,1981和第2版.,1991中发现。另外,所述化合 物的盐在本发明的范围内。例如,盐可在带有正电荷的氨基取代基和 带有负电荷的反离子之间形成。

本发明化合物的实例包括SC141-144、SC148、SC153-158、 SC160-176、SC20-37、SC201-266、SC268和SC270-280。

太阳城集团本发明的化合物可以例如根据下述方案制备。

太阳城集团一般而言,水杨酰肼(SC)可按如下制备:在无水二_烷(40mL) 中的芳香酸(10mmol)、五氟苯酚(11mmol)和二环己基碳化二亚 胺(DCC)(10mmol)的混合物在室温下搅拌(过夜)。通过C盐由 过滤除去二环己基脲,滤出液进行干燥并通过结晶或通过硅凝胶色谱 法(Zhao and Burke(1997)Tetrahedron 53:4219-30)直接纯化。

此处插入反应图

Pfp-五氟苯基;每个R和R′,独立地或共同地是氢原子、卤素 原子、羟基,或任何其他含有任意数量的碳原子,优选1-20个碳原 子和任选地包括杂原子例如氧、硫或氮的直链、支链或环状结构形式 的有机基团。代表性的R和R′基团包括但不限于烷基、取代烷基、烯 基、取代烯基、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂 芳基。代表性的取代基包括但不限于卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、 苯氧基、芳氧基、氰基、异氰基、羰基、羧基、氨基、酰氨基、磺酰 基,和取代杂环、糖或肽。

为了制备水杨酸五氟苯酯,将在二_烷(180mL)中的水杨酸 (4.14g,30mmol)、五氟苯酚(5.52g,33mmol)和DCC(6.3g,30mmol) 的混合物搅拌在室温下过夜。通过C盐由过滤除去二环己基脲,滤出 液干燥。从醚:己烷结晶残留物得到为白色固体的水杨酸五氟苯基酯 (4.56g,产率50%),mp 111-111.5℃,IH NMR(CDC13)89.83 (s,1H)、8.06(dd,J=8.1,1.6Hz,1H)、7.63-7.56(m,1H)、 7.08-6.97(m,2H)。

为了制备吡啶甲酸五氟苯基酯,如上所述将吡啶甲酸(1.23g, 10mmol)与五氟苯酚(1.84g,10mmol)在二_烷(30mL)中反应。通过 硅凝胶色谱法随后通过结晶进行纯化提供了为白色固体的吡啶甲酸五 氟苯基酯(1.52g,53%),mp 62-64℃(醚:己烷),JH NMR(CDCI3) 88.87(d,J=4.5Hz,IH)、8.29(d,J=7.9Hz,IH)、7.99-7.92 (m,1H)、7.64-7.56(m,IH)。

太阳城集团为制备N,N′-双-水杨酰肼,如上所述将水杨酸五氟苯基酯 (304mg,1.0mmol)与无水肼或肼一水合物反应。提供了为白色固体 的N,N′-双-水杨酰肼(分别为123mg,90%和130mg,95%),mp 315-316 ℃(EtOAc)(lit.5,302℃),IH NMR(DMSO-d6)511.78(s, 2H)、10.89(s,2H)、7.92(dd,J=7.8,1.3Hz,2H),7.49-7.42 (m,2H)、7.0-6.94(m,4H);IR(KBr)3088、1654、1605、1484、 1234、754;FABMS m/z 273(MH+)。分析(CI4HIzNzO4):C,61.76; H,4.44;N,10.29。实测值:C,61.66;H,4.51;N,10.37。

为制备N,N′-双-吡啶甲酰肼,如上所述,将吡啶甲酸五氟苯基酯 (289mg,1.0mmol)与无水肼或肼一水合物反应。提供了为白色固体 的N,N′-双-吡啶甲酰肼(分别为110mg,91%和96mg,80%),mp 224-225 ℃(EtOAc),IH NMR(DMSO-d6)810.63(s,2H)、8.70(d,J= 4.8Hz,2H)、8.05-8.04(m,4H)、7.69-7.63(m,2H);IR(KBr) 3321、1676、1560、1482;FABMS m/z 243(MH+)。分析(CIeHIoN40:): C,59.50;H,4.16;N,23.13。实测值:C,59.45;H,4.17;N, 23.07。

SC141-SC144、SC148和SC153-158的合成可以分别由适当的4- 氯吡咯并[1,2-a]喹_啉13a-c(Nagarajan等(1972)Indian J.Chem. 10:344-350和Guillon等(2004)J.Med.Chem.17:1997-2009)或 6-氯咪唑并[1,2-a]吡啶并[3,2-e]吡嗪13d(Campiani等(1997)J. Med.Chem.40:3670-3678)和肼一水合物起始得到基本上纯的4-肼 基吡咯并[1,2-a]喹_啉14a-c和6-肼基咪唑并[1,2-a]吡啶并[3,2-e] 吡嗪14d(方案1)来完成。在不同的实验条件下,可以进行随后的 N-酰化步骤:SC141和SC142可由化合物14a分别与吡咯-2-羧酸氯化 物和烟酰氯盐酸盐反应获得;而SC143、SC144和SC148可通过使用 2,2′-二硫基联吡啶和三苯膦作为缩合剂由衍生物14b-d与商购的2- 吡嗪羧酸反应获得(Di Fabio等(1993)Tetrahedron 43:229-2306)。 通过盐酸1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺(EDC)/4-(二 甲氨基)吡啶(DMAP)系统,肼衍生物14a和适当的吲哚羧酸之间的缩 合产生化合物SC155-158;可以由化合物14a分别与N-BOC-四氢噻唑 -4-羧酸或N-BOC-β-丙氨酸起始,再次使用EDC/DMAP作为脱水系统, 最终通过使用三氟乙酸(TFA)/苯甲醚的方法去保护合成化合物 SC153和SC154的N-BOC-衍生物。

此处插入反应式

方案1

双衍生物SC147的制备通过肼一水合物与两摩尔当量的吡咯并 [1,2-a]喹_啉-4-羧酸乙酯15的直接反应进行,可在Nagarajan等 ((1972)Indian J.Chem.10:344-350)(方案2)的方式后依次获 得。

方案2

太阳城集团在EDC/DMAP随后在TFA和苯甲醚的存在下,通过14a分别与 Boc-3-氨基-3-(2-氯苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-氯苯基)丙酸、 Boc-3-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸、Boc-3-氨基-3-(4-氰苯基)丙酸、 Boc-3-氨基-3-(4-甲氧苯基)丙酸和Boc-3-氨基-3-(4-三氟甲基苯基) 丙酸反应可以得到SC160、SC161、SC162、SC163、SC164和SC165(方 案3)。

在EDC/DMAP随后TFA和苯甲醚的存在下,通过14a分别与方案4 中显示的相应的酸(15a-g)反应可以得到SC166、SC167、SC168、SC169、 SC170、SC171和SC172(方案4)。

太阳城集团通过14a与2-喹_啉羧酸、二氯甲烷、三苯膦和2,2′-二硫基联 吡啶的反应可以得到SC173;通过14a与吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-羧 酸、二氯甲烷、三苯膦和2,2′-二硫基联吡啶的反应可以得到SC174。

太阳城集团通过烟酰氯盐酸盐与9-肼基-9H-吡咯并[1,2-a]吲哚和吡啶的反 应可以得到SC175;通过盐酸吡嗪-2-碳酰氯或吡嗪-2-碳酰氯与9-肼 基-9H-吡咯并[1,2-a]吲哚和吡嗪的反应得到SC176(方案5)。

组合物

本发明的化合物可掺入药物组合物中。该组合物典型地包括化合 物和药学可接受的载体。“药学可接受的载体”包括与药物适用相容 的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。 其他活性化合物(例如,紫杉醇、阿霉素或5-FU)也可掺入组合物中。

可配制药物组合物以使其适合于预期的施用途径。参见。例如, 美国专利第6,756,196号。施用途径的实例包括肠胃外,例如,静脉 内、皮内、皮下,经口(例如,吸入),经皮(局部),经粘膜和直 肠施用。用于肠胃外,皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括以下成 分:无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、 甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗菌剂例如苯甲醇或甲基对羟基苯甲 酸酯;抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂例如乙二胺四乙 酸;缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,用于调节张力的试剂例 如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱调节,例如盐酸或氢氧化钠。肠胃 外制剂可用安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量的小瓶包 装。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(溶于水的)或用于 临时制备无菌注射溶液或分散液的分散体和无菌粉末。对于静脉内施 用,适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,组合物 必须是无菌的并且应该其流动性易于通过注射器。其在制造和存储的 条件下应该是稳定的,且必须保护其不受微生物例如细菌和真菌作用 的污染。载体可以是溶剂或分散介质包含,例如,水、乙醇、多元醇 (例如,甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)及其适当的混合物。可以 例如,通过使用包衣例如卵磷脂,在混悬液的情况下通过维持所需粒 子大小和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以通过多种抗菌 剂和抗真菌剂,例如,对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血 酸、硫柳汞等实现微生物的预防。在许多情况中,优选在组合物中包 括等渗剂,例如糖,聚醇例如甘露醇、山梨醇,氯化钠。可以通过在 组合物中包括延迟吸收的试剂,例如,单硬脂酸铝和明胶来使注射用 组合物的吸收延长。

太阳城集团无菌注射用溶液可以通过在适当的溶剂中掺入所需量的化合物和 上述列举的一种成分或组合来制备,如果需要,随后通过过滤除菌。 一般而言,分散体通过将化合物掺入无菌载体来制备,无菌载体含有 基本的分散介质和所需的上述列举的其他成分。在用于制备无菌注射 溶液的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥, 其产生活性成分和任一另外所需来自其先前无菌过滤溶液的成分的粉 末。

太阳城集团口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。为了口服施用 的目的,可以将化合物和赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊如明胶胶 囊的形式使用。口服组合物也可使用液体载体制备,用作漱口剂。药 物相容的粘合剂和/或辅料可作为组合物的一部分被包括。片剂、丸 剂、胶囊、锭剂等可含有任意以下成分,或相似性质的化合物:粘合 剂例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶;赋形剂例如淀粉或乳糖;崩解 剂例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂例如硬酯酸镁或 Sterotes;助流剂例如胶体二氧化硅;甜味剂例如蔗糖或糖精;或调 味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、或桔子香精。

对于吸入使用,化合物以气溶胶喷雾剂形式从含有适当抛射剂例 如气体,例如二氧化碳的加压容器或分配器或喷雾器递送。

全身施用也可以通过经粘膜或经皮的方式使用。对于经粘膜或经 皮施用,在制剂中使用适于渗透屏障的渗透剂。在本领域这样的渗透 剂通常是已知的,包括例如对于经粘膜施用,洗涤剂、胆盐和夫西地 酸衍生物。通过使用鼻喷雾或栓剂实现经粘膜给药。对于经皮施用, 可将化合物配制成本领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。

对于直肠使施用,化合物也可以制备成栓剂(例如使用常规栓剂 基质例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂(retention enemas) 的形式以递送。

在一个实施方案中,可将化合物与防止化合物由身体快速消除的 载体,例如控释制剂,包括植入物和微囊化释放系统的载体一起制备。 可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯醋酸乙烯酯、 聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酯和聚乳酸。制备这样制剂的方法对本 领域技术人员是显而易见的。材料也可从Alza公司和Nova制药公司 商购获得。脂质体混悬液(包括靶向于含有病毒抗原单克隆抗体的感 染细胞的脂质体)也可作为药学可接受的载体使用。这些可通过本领 域技术人员已知的方法制备,例如,描述于美国专利第4,522,811号。

配制便于施用和使剂量一致的剂量单位形式的口服或肠胃外组合 物是有利。如本文所用“剂量单位形式”指适合作为用于所治疗的患 者的单一剂量的的物理离散单元;每个单元含有预先确定的计算量的 以产生所需治疗效果的活性化合物与所需的药物载体。

药物组合物可以包括在容器、包装或分配器中,与施用说明书一 起形成包装产品。例如,包装产品可包括容器、有效量的本发明化合 物;和与容器有结合的说明书,其说明施用该化合物可治疗癌症或与 血管生成功能相联系的疾病。

在另一实例中,有效量的式XI或XII的化合物,

式XI                式XII

其中Ar包括芳香环和Het包含杂环,可以包装于与说明书结合的 容器中。说明书与容器结合并含有施用该化合物以治疗非小细胞肺癌、 CNS癌、卵巢癌、乳癌、肾癌和前列腺癌、与年龄相关的黄斑变性、 黄斑营养不良或糖尿病的说明。

作为选择,有效量的结构式II化合物,

式II

其中R是H、烷基或卤素;R′是H、烷基或卤素;X是CH或N;和 Y包含同素环或杂环,可以包装于与说明书结合容器的中。说明书与 容器结合并含有施用化合物以治疗癌症或与血管生成功能相联系的疾 病。

包装产品可进一步的包括有效量的一种或多种用于治疗癌症或与 血管生成功能相联系的病症的其他药物,例如,紫杉醇、阿霉素或 5-FU。

用途

治疗方法

太阳城集团本发明提供了处理需要有效量的上述化合物或组合物的患者的预 防和治疗方法。

太阳城集团如本文所用,“患者”指人类或动物,包括所有的脊椎动物,例 如,哺乳动物,如灵长类(尤其是高级灵长类)、绵羊、狗、啮齿动 物(例如小鼠和大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛,和非哺乳动 物,例如鸡、两栖动物、爬行动物等。在优选的实施方案中,患者是 人类。在另一个实施方案中,患者是实验动物或适合作为疾病模型的 动物。

可以例如使用本领域已知的诊断方法鉴别所治疗的患者,因为患 有或有发生癌症或与血管生成功能相联系的疾病,也就是血管生成的 危险,经常伴有恶性组织的生长。根据患者或卫生保健专业人员的判 断对患者进行鉴别,可以是主观(例如,意见)或客观的(例如,通 过测试或诊断方法测定)。癌症的实例包括白血病、非小细胞肺癌、 结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、肾癌或前列腺癌;与血 管生成功能相联系的疾病实例包括与年龄相关的黄斑变性、黄斑营养 不良或糖尿病。

太阳城集团如本文所用,术语“治疗”定义为给患者应用或施用治疗剂,或 给具有疾病、疾病症状或针对疾病的素因的患者分离的组织或细胞株 应用或施用治疗剂以达到治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、改善、改 进、提高或影响疾病、疾病的症状或针对疾病的素因。

“有效量”是在治疗患者中能产生本文所述的医学上所需结果的 治疗剂的量。医学上所需的结果可以是客观的(也就是通过某些测试 或标志测定)或主观的(也就是患者给出的指征或感觉的效果)。

化合物的毒性和治疗效能可通过标准的药学操作在细胞培养物或 实验动物中测定,例如,测定LD50(50%群体的致死剂量)和ED50(50 %群体的治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指 数,其可表示为比例LD50/ED50。优选呈现高治疗指数的化合物。虽然 可以使用呈现毒副作用的化合物,但是需要仔细设计将化合物靶向于 受侵袭部位的递送系统以将对未感染细胞的潜在损害减到最小,并由 此减少副作用。

由细胞培养物试验和动物研究中获得的数据可用于设计用于人类 的剂量范围。化合物的剂量优选位于包括具有很小或没有毒性的ED50循环浓度的范围内。剂量可以在该范围内变化,这取决于使用的剂型 和使用的施用途径。对于在本发明方法中使用的任意化合物,可从细 胞培养物试验估计最初的治疗有效剂量。可以在动物模型中设计剂量 以获得包括在细胞培养物中测定的IC50(也就是达到半数最大症状抑 制的化合物浓度)的循环血浆浓度范围。该太阳城集团可用于更准确的确定 人类的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测定血浆水平。

化合物的治疗有效量(也就是,有效剂量)可在以下范围内变化, 例如每千克约1微克至每千克约500毫克,每千克约100微克至每千 克约5毫克,或每千克约1微克至每千克约50微克。化合物每周施用 一次,可施用例如约1至10周,优选2至8周,更优选约3至7周, 甚至更优选约4、5或6周。此外应理解化合物的适当的剂量取决于化 合物的效力。当给患者(例如,动物或人类)施用一种或多种化合物 时,医师、兽医或研究人员可以首先开出相对的低剂量的处方,随后 增加剂量直至获得适当的反应。而且应该理解任何特定患者的具体剂 量水平将取决于多种因素,包括使用的具体化合物的活性、患者的年 龄、体重、总的健康状况、性别,饮食、施用太阳城集团、施用途径、排泄 速率、任何药物联合、疾病或病症的严重程度、先前的治疗,和存在 的其他疾病。而且用治疗有效量的化合物治疗患者可包括单一治疗或 优选包括一系列治疗。

太阳城集团治疗可进一步包括给患者施用有效量的一种或多种用于治疗癌症 或与血管生成功能相联系的疾病其他治疗剂,例如,紫杉醇、阿霉素 或5-FU。当使用多种治疗剂时,可以混合剂量或单剂量,同时或顺序 施用。

使用PET技术监测治疗的方法

已经设计了特别适合于小型动物成像的小型化、高分辨率的使用 新检测器技术的PET扫描器(Holdsworth和Thornton(2002)Trends Biotechnol.20:S34-39和Lewis et al.(2002)Eur.J.Cancer 38:2173-2188)。该方法能够快速检测植入小鼠的人类肿瘤异种移植物 的药效以在对人类测试以前使药物PK和给药方案最佳。这样的体内评 价能够预测候选药物的成功,因此在药物发现过程中过滤掉早期的潜 在的临床候选者。当应用于药物发现和开发时,通过功能性PET成像 获得的太阳城集团可以分为四类:(1)标记的候选药物的吸收、分布、代谢和 消除;(2)药物向令人感兴趣的特定靶点(例如肿瘤)的递送;(3)药 物与候选药物与希望的分子靶点(例如酶或细胞表面受体)的相互作 用;和(4)需要的PD效果(例如细胞杀灭或细胞周期阻滞)或不需要 的效果的测定。非侵入PET成像技术能够更准确的滴定治疗剂量,而 且使用标记形式的药物能够更快速描述体内与有效性有关的PK和PD 的特征。这必然会提高数据质量、减少成本或所使用的动物数量,最 重要的是减少新化合物的检查太阳城集团。

在人类患者中已经广泛使用了具有葡萄糖类似物[18F]氟脱氧葡萄 糖([18F]FDG)的PET成像以使原发性癌症显象,其准确度高并且能够 定量癌症对抗肿瘤治疗的反应;可在参考文献(Bellon等(2004)Am.J. Clin.Oncol.27:407-410以及Eubank和Mankoff(2004)Semin. Nucl.Med.34:224-240)中找到其在乳癌中的实例。通过PET对新药 物在小鼠体内的有效性进行早期评价能够极大的帮助为将来的临床研 究选择正确的药物。通过PET/[18F]FDG成像能够定量肿瘤细胞高的糖 酵解率。FDG通过己糖激酶被磷酸化,产生带有负电荷的FDG-6-磷酸 酯,其在细胞中可被有效地捕获。通过PET测定的增加的肿瘤FDG吸 收与活肿瘤密度(即每单位组织容积的活细胞数)高度相关。因为FDG 摄取是肿瘤细胞存活的表现(Higashi等.(1993)J.Nucl.Med. 34:773-779),具有有效肿瘤治疗的FDG摄取的减少反映了肿瘤细胞的 杀灭。在实验动物模型中对肿瘤反应进行评估在药物开发中是至关重 要的,对于该目的而言FDG PET是理想的工具。实际上,很多临床试 验已经表明肿瘤[18F]-FDG摄取的数量变化可以提供抗癌药早期的、敏 感的破坏癌细胞的药效学标志物。在化疗期间FDG PET成像的变化是 患有各种癌症的患者反应的预兆,所述癌症是例如乳癌(Avril等 (2000)J..Clin.Oncol.18:3495-3502),肺癌(Higashi等(2002) J.Nucl.Med.43:39-45),头部和颈部癌(Halfpenny等(2002)Br. J.Cancer 86:512-516)以及淋巴瘤(Lowe和Wiseman(2002)J.Nucl. Med.43:1028-1030)(综述,参见Czernin和Phelps(2002)Annu.Rev. Med.53:89-112,Cohade和Wahl(2002)Cancer J.8:119-134,以 及Nabi和Zubeldia(2002)J.Nucl.Med.Technol.30:3-9;quiz 10-11)。这些研究证明与使用基于肿瘤大小变化的常规方法相比PET 能够在治疗方案的更早阶段鉴别对治疗的临床反应。

高度增殖细胞的重要的特征是其显著的DNA合成速率。引入DNA 合成途径的PET探针是测定肿瘤生长速率和治疗对肿瘤细胞分裂影响 理想的试剂。这类试剂的原型试剂是胸苷。不幸的是,由于其在体内 快速分解代谢使得胸苷应用受到限制。(Conti等(1994)Nucl.Med. Biol.21:1045-1051)。在过去的十年中已经鉴别了几种耐受酶降解并 且可以高度特异性和亲合力引入DNA的胸苷放射性标记类似物(参见, 例如,Czernin和Phelps(2002)Annu.Rev.Med.53:89-112,Cohade 和Wahl(2002)Cancer J.8:119-134)。一种这样的放射性示踪剂, 使用C-11标记的2′-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶 (FMAU)(半衰期20分钟)显示出用于PET肿瘤成像的前景(Conti等 (1995)Nucl.Med.Biol.22:783-789,Bading等(2000)Nucl.Med. Biol.27:361-368,和Bading等.(2004)Nucl.Med.Biol. 31:407-418)。在细胞摄取之后,FMAU被胸苷激酶磷酸化并引入DNA。

因此,本发明提供了监测患者治疗的方法。该方法包括给具有癌 症细胞或与血管生成功能疾病相联系的细胞施用如上所述的化合物并 使用PET成像测定细胞的存活、细胞的生长或其组合。患者患有白血 病、非-小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌症、黑色素瘤、卵巢癌、乳癌、 肾癌或前列腺癌。患者可以是动物,例如小鼠,细胞可以是异种移植 人类细胞。优选地,患者是人。

太阳城集团构建基因表达谱的方法

太阳城集团响应于药物治疗的基因表达模式是药物作用机制、耐受机制和细 胞途径的强有力的指示。例如,通过DNA微阵列技术构建基因表达的 谱可用于鉴别和确认药物靶点和监测药物治疗。

因此,本发明提供了通过使试验细胞与上述化合物接触并构建试 验细胞的基因表达谱来构建基因表达谱的方法。特别地,试验细胞可 以是癌细胞或与血管生成功疾病相联系的细胞,例如白血病细胞、非- 小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞、CNS癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌 细胞、乳癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞或与年龄相关的黄斑变性, 黄斑营养不良,或糖尿病相联系的细胞。将试验细胞的基因表达与对 照细胞,例如未与该化合物接触的细胞,或与具有已知作用的另一种 化合物接触的细胞或耐受该化合物的细胞进行比较。这样的比较对于 理解该化合物的作用提供了有益的太阳城集团。

太阳城集团可以在mRNA和蛋白水平测定基因表达。通过从试验对象获得生物 样品并将生物样品与能够检测蛋白质或编码该蛋白质的核酸(例如 mRNA,基因组DNA)来评估生物样品中蛋白质或核酸的存在、水平或 缺失以检测生物样品中蛋白质或核酸的存在。术语“生物样品”包括 从患者分离的组织、细胞和生物液以及在患者中存在的组织,细胞和 液体。基因表达的水平可以使用很多方法进行测量,包括但是不限于 测量由基因转录的mRNA,测量由该基因编码的蛋白质的量,或测定该 基因编码的蛋白质的活性。

可以通过原位和通过体外形式(in vitro formats)测定细胞基 因转录的mRNA水平。可在杂交或扩增试验,包括但不限于Southern 或Northern分析,聚合酶链式反应分析和探针阵列中使用分离的 mRNA。一个优选的检测mRNA水平的诊断方法包括使分离的mRNA与可 以与由被检测基因转录的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。探针可以 布置在地址上。

在一个形式(one format)中,将mRNA(或cDNA)固定在表面上并 与探针接触,例如,通过在琼胶糖凝胶上跑(running)分离的mRNA 然后将mRNA由凝胶转移至薄膜,例如硝酸纤维。在可选的形式 (alternative format)中,将探针固定在表面并将mRNA(或cDNA) 与探针接触,例如,在两维基因芯片阵列(two-dimensional gene chip array)中。熟练技术人员可以采用已知的mRNA检测方法用于检测由 该基因转录的mRNA的水平。

样品中的mRNA水平可以通过核酸扩增,例如通过RT-PCR(U.S 专利第4,683,202号),连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88:189-193),自身连续序列复制技术(Guatelli等. (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878),转录扩增体 系(transcriptional amplification system)(Kwoh等(1989)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177),Q-β复制酶(Lizardi等 (1988)Bio/Technology 6:1197),滚环复制(U.S.专利第5,854,033) 或任何其它核酸扩增方法,随后使用本领域已知的技术检测扩增的分 子。如本文所用,将扩增引物定义为能够退火至基因的5′或3′区域的 (分别添加和减去链,或相反)和在其之间含有短区域的一对核酸分 子。通常扩增引物为大约10至30个核苷酸长并有大约50至200个核 苷酸长度的侧端区域。在适合的条件下并使用合适的试剂,这样的引 物可扩增包括由该引物侧翼延长(flank)的核苷酸序列的核酸分子。

太阳城集团对于原位方法,可以制备/处理细胞或组织样品并将其固定在支持 物上,典型地为载玻片,然后与能够与由被分析基因转录的mRNA杂交 的探针接触。

可以使用多种方法测定由该基因编码的蛋白质水平。一般而言, 这些方法包括用可特异性结合的试剂接触蛋白,例如抗体与样品接触 以评估样品中蛋白质水平。在优选的实施方案中,抗体带有可检测标 记。抗体可以是多克隆抗体,或者更优选单克隆抗体。可以使用完整 的抗体或其片段(例如,Fab或F(ab′)2)。对于探针或抗体,“标记 的”意欲包括通过将可检测的物质结合(例如物理连接)至探针或抗 体来直接标记探针或抗体,以及通过与可检测物质的反应来间接标记 探针或抗体。

可以使用检测方法来检测体外以及体内的生物样品中的蛋白。体 外检测蛋白的技术包括酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫沉淀法、免 疫荧光法、酶免疫分析法(EIA)、放射免疾分析法(RIA)、和Western 印迹分析。体内测定蛋白的方法包括将标记的抗体引入受试者中。例 如可以使用放射性标记物标记抗体,其在受试者体内的存在和位置可 以通过标准的成像技术进行检测。在另一个实施方案中,样品被标记 例如生物素化,然后与抗体接触,例如位于抗体阵列中的抗体。可例 如用与荧光标记偶合的抗生物素蛋白检测样品。

太阳城集团现在充分确定DNA微阵列技术可同时定量数千基因的表达。目前 这种方法强大(robust)、可重复并且高效。其可用于评估细胞途径 和确认药物靶点(参见,例如Clarke等(2001)Biochem.Pharmacol. 62:1311-1336,Onyango(2004)Curr.Cancer Drug Targets 4:111-124,和Weinstein(2002)Curr.Opin.Pharmacol. 2:361-365)。

Paull等((1989)J.Natl.Cancer Inst.81:1088-1092)首先认 识到根据它们对全部NCI 60种人癌细胞株的生长抑制谱的相似性将化 合物分类归并到推测的机械分组(mechanistic groupings)。它们开 发了一种根据基于其细胞毒性谱评估化合物相似程度的模式识别算法 的称为″COMPARE″的计算机程序。根据它们公布的并且广泛接受的分子 靶点对一些化合物进行了分类。最近,NCI的Dr.John Weinstein及 其同事发明了一种称为″DISCOVERY”的软件包以使用含有1,200个基 因的cDNA芯片比较60种细胞株的基因表达分析(Weinstein等(1997) Science 275:343-349)。可确定基因表达模式与60种细胞株响应于特 定化合物的细胞毒性谱之间的相关性(Scherf等(2000)Nat.Genet. 24:236-244)。使用这种方法,可以鉴别这些化合物的靶点或途径。 然后DISCOVERY允许通过相关联的细胞表达来鉴别为这些途径所共有 的基因。这种公众可得到的软件允许相对于有5000个化合物的数据库 在NCI 60种人癌细胞株中来比较化合物(参见 discover.nci.nih.gov的NCI网站)。

太阳城集团通过构建对治疗化合物敏感的图谱而鉴别的基因可用作治疗标记 物。而这些标记物可用于监测用该化合物对患者进行的治疗。例如, 对SC144敏感的基因小分子富脯氨酸蛋白1A;在骨骼肌中过量表达的 GTP结合蛋白;白细胞介素24;sestrin 2;假定蛋白MGC4504;细 胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21);早期生长应答1;ATP 酶、H+转运、溶酶体38kDa、V0亚型d同工型(isoform)2;AXIN1 向上调节1;双重特异性磷酸酶5;超氧化歧化酶2、线粒体;肝素结 合表皮生长因子样生长因子;A分解蛋白和金属蛋白酶域19(融合素 β);内皮PAS域蛋白1;肌醇1,4,5-三磷酸酯受体,1型;组织因子 通道抑制剂(脂蛋白结合的凝固抑制剂);纤维蛋白原、γ多肽;RAB20、 RAS致癌基因族成员;蛋白激酶、AMP-活性,γ2非催化亚单位;制 瘤素M受体;组织蛋白酶B;B细胞抑制剂中的核素κ轻多肽基因增强 子的核因子,α;BcL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3;整联蛋白, β3(血小板糖蛋白IIIa,抗原CD61);双重特异性磷酸酶10;细胞 周期调节蛋白SDP35;plexin C1;小眼球结合转录因子;钙激活蛋白 酶小亚型2;假定蛋白DKFZp434L142;MEGF 10蛋白;EphA2;jagged 1(Alagille综合征);hemicentin;低密度脂蛋白受体(肝素结合 表皮生长因子样生长因子);酪氨酸酶相关蛋白1;酪氨酸酶(眼皮 肤白化病IA);多巴色素互变异构酶(多巴色素δ-异构酶、酪氨酸 相关蛋白2);层粘连蛋白,β3;MAX二聚蛋白1;CDK4-结合蛋白 p34SEIl;人类cDNA FLJ42435 fis,克隆BLADE2006849;生长停止 和DNA-损伤-诱导,β;细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂2B(p15, 抑制CDK4);白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子); 突触融合蛋白结合蛋白6(amisyn);转运分泌蛋白2.2;Arg/Abl相互 作用蛋白ArgBP2;假定蛋白DJ667H12.2;人cDNA FLJ37284 fis、克 隆RAMY2013590。这些基因的一个或多个可用作监测用SC144对患者 进行的治疗的标记物,例如测定化合物的效力。

调节细胞生长、细胞周期、凋亡、或基因表达的方法

太阳城集团本发明的另一个方面涉及为治疗目的而调节细胞生长、细胞周期、 凋亡、或基因表达或活性的方法。因此,本发明的调节方法包括用上 述调节细胞生长、细胞周期、凋亡、或一种或多种与该细胞相联系的 基因的基因表达的化合物与细胞接触。测量细胞生长、细胞周期、凋 亡、或基因表达或活性的方法在本领域是已知的。在以下的实施例和 上文叙述中提供了这样的方法的实例。

调节的基因的实例包括小分子富脯氨酸蛋白1A;在骨骼肌中过量 表达的GTP结合蛋白;白细胞介素24;sestrin 2;假定蛋白MGC4504; 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21);早期生长应答1;ATP 酶、H+转运、溶酶体38kDa、V0亚型d同工型(isoform)2;AXIN1 向上调节1;双重特异性磷酸酶5;超氧化歧化酶2、线粒体;肝素结 合表皮生长因子样生长因子;A分解蛋白和金属蛋白酶域19(融合素 β);内皮PAS域蛋白1;肌醇1,4,5-三磷酸酯受体,1型;组织因子 通道抑制剂(脂蛋白结合的凝固抑制剂);纤维蛋白原、γ多肽;RAB20、 RAS致癌基因族成员;蛋白激酶、AMP-活性,γ2非催化亚单位;制 瘤素M受体;组织蛋白酶B;B细胞抑制剂中的核素κ轻多肽基因增 强子的核因子,α;BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3;整联蛋 白,β3(血小板糖蛋白IIIa,抗原CD61);双重特异性磷酸酶10; 细胞周期调节蛋白SDP35;plexin C1;小眼球结合转录因子;钙激活 蛋白酶小亚型2;假定蛋白DKFZp434L142;MEGF 10蛋白;EphA2; jagged 1(Alagille综合征);hemicentin;低密度脂蛋白受体(肝 素结合表皮生长因子样生长因子);酪氨酸酶相关蛋白1;酪氨酸酶 (眼皮肤白化病IA);多巴色素互变异构酶(多巴色素δ-异构酶、 酪氨酸相关蛋白2);层粘连蛋白,β3;MAX二聚蛋白1;CDK4-结 合蛋白p34SEIl;人类cDNA FLJ42435 fis,克隆BLADE2006849;生 长停止和DNA-损伤-诱导,β;细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂 2B(p15,抑制CDK4);白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生 长因子);突触融合蛋白结合蛋白6(amisyn);转运分泌蛋白2.2; Arg/Abl相互作用蛋白ArgBP2;假定蛋白DJ667H12.2;人cDNA FLJ37284 fis、克隆RAMY2013590;BCL2、BCL2L1、JUN、JUNB、MAD、 MAX、TNFRSF1A、TP53、NFKB1、TNFSF10、CASP1、PCNA、TNFAIP1、 DAP、KDR、MAP3K14、CCNA2、CDC2、CDK7、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、 CDKN2A、CDKN2C、E2F1、E2F4、E2F5、MYC、RB1、RBL2、CCND3、CCNG1、 CCNE1、CDC25C、TGFBR2、TGIF、TRAF4、CYP1A2、PTGS2、(p21)、p27、 细胞周期蛋白A、cdk1、p53、细胞周期蛋白E、cdc25、p130、NFKB、 c-MYC、COX2、Bcl-XL、膜联蛋白V(annexin V)、caspase 1、TNF 受体、微管结合蛋白4、微管亲合力调节激酶2、微管亲合力调节激 酶4、ERBB2转导子、血管内皮生长因子B、血管内皮生长因子、锚蛋 白重复序列和MYND域1、RAB4B、假定前列腺癌肿瘤抑制基因、前B 细胞白血病转录因子2、T-细胞白血病易位改变基因、白血病抑制因 子、干扰素调节因子2结合蛋白、干扰素刺激基因(20kDa)、干扰素γ 受体2、28kD干扰素应答蛋白、聚合酶(RNA)III、过氧化物酶增值 子活性受体A相互作用复合物285、RAD50同系物(S.cerevisiae)、 MAX二聚蛋白3、kruppel样因子16、载脂蛋白L(6)、X射线修复互 补缺陷修复、细胞分裂素活化蛋白激酶3、磷脂酰肌醇4-激酶II型、 细胞分裂素活化蛋白激酶12、蛋白激酶(AMP-活化,α2催化亚型)、 丙酮酸脱氢酶磷酸酶调节亚型、磷脂酶D3、肌醇1,4,5-三磷酸酯受体 (3型)、维甲酸受体(α)、肿瘤坏死因子受体超家族、烯醇化酶2(γ, 神经元)、stanniocalcin 2、apelin、plexin B2、组织蛋白酶Z、 组蛋白1(H2bc)、组蛋白1(H3h)、β-微管蛋白、myc启动子结合 蛋白(MPB-1)、视网膜母细胞瘤结合蛋白7、波形蛋白、烯醇化酶、 磷酸丙酮酸水合酶β,和线粒体ATP合酶β链。

在一个实施方案中,该化合物刺激细胞中一个或多个基因的表达。 例如SC144刺激小分子富脯氨酸蛋白1A;在骨骼肌中过量表达的GTP 结合蛋白;白细胞介素24;sestrin 2;假定蛋白MGC4504;细胞周 期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1A(p21);早期生长应答1;ATP酶、 H+转运、溶酶体38kDa、V0亚型d同工型(isoform)  2;AXIN1向 上调节1;双重特异性磷酸酶5;超氧化歧化酶2、线粒体;肝素结合 表皮生长因子样生长因子;A分解蛋白和金属蛋白酶域19(融合素 β);内皮PAS域蛋白1;肌醇1,4,5-三磷酸酯受体,1型;组织因子 通道抑制剂(脂蛋白结合的凝固抑制剂);纤维蛋白原、γ多肽;RAB20、 RAS致癌基因族成员;蛋白激酶、AMP-活性,γ2非催化亚单位;制 瘤素M受体;组织蛋白酶B;B细胞抑制剂中的核素κ轻多肽基因增强 子的核因子,α;BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3;整联蛋白, β3(血小板糖蛋白IIIa,抗原CD61);双重特异性磷酸酶10的表达。 在另一个实施方案中,该化合物抑制细胞中一种或多种基因的表达。 例如,SC144抑制细胞周期控制蛋白SDP 35、plexin Cl、小眼球结合 转录因子、钙激活蛋白酶小亚型2、假定蛋白DKFZp434L142的表达。

太阳城集团这些调节方法可以在体外例如,通过用将该化合物与细胞一起培 养来进行。例如,细胞可以是癌细胞(例如,白血病细胞、非小细胞肺 癌细胞、结肠癌细胞、CNS癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、乳 癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞)或与血管生成功能疾病相联系的细 胞(例如,与年龄相关的黄斑变性,黄斑营养不良,或糖尿病相联系的细 胞)。可选地,调节方法可以在体内例如通过给患者例如患有或有发生 癌症或与血管生成功能相联系的疾病危险的患者施用该化合物来进 行。因而,本发明提供治疗受以异常或有害细胞生长、细胞周期、凋 亡、或一种或多种基因表达为特征的疾病或病症折磨的患者的方法。 在基因异常向下调节和/或增加基因表达可能具有有益效果的情形下 需要刺激细胞的表达。同样,在基因表达异常向上调节和/或减少基因 表达可能具有有益效果的情形下需要抑制细胞的表达。

太阳城集团以下实施例意欲解释而不是限制本发明的范围。虽然这些实施例 是可以使用的典型实施例,但是可选择性地使用本领域技术人员已知 的其它方法。实际上,本领域的普通技术人员基于本文的教导而无需 过多的试验能够容易地预见和提出进一步的实施方案。

实施例

实施例I

化学

所有反应在氮气气氛下进行。通过硅胶板TLC(Merck 60,F254,0.2 mm)监测反应进程。用MgSO4干燥有机溶液;蒸发指减压下在旋转蒸发 器上除去溶剂。使用Gallenkamp装置测定熔点并且没有进行校正。在 Perkin-Elmer 398和FT 1600分光光度计上以薄膜记录IR图谱。在 Brüker 300-MHz分光计上使用TMS作为内标记录1H NMR图谱;以δ 值(ppm)表示化学位移并且以(J)Hz表示偶合常数。使用VG70分光 计以70eV通过顺向插入测定质谱数据。使用Merck硅胶(Kieselgel 60/230-400目)作为快速色谱柱。在Perkin-E1mer 240C元素分析仪 上进行元素分析,并且结果在理论值的±0.4%的范围内。产率指纯化 产物并且没有最佳化。

制备化合物14a-14d的一般方法。描述作为代表性实施例的7-氟 -4-肼基吡咯并[1,2-a]喹_啉14c的制备。

将7-氟-4-氯吡咯并[1,2-a]喹_啉13c(100mg,0.45mmol),肼 一水合物(5mL),和DMF(2mL)加热至70-80℃1小时。然后加入碎冰 并周EtOAc萃取混合物。分离有机层并相继与水和盐水一起振摇。蒸 发掉挥发物后,得到为固体的化合物14c(84mg,产率86%),在随后的 步骤中使用而没有作进一步纯化。通过结晶获得分析样品;mp 158℃ (dec.)(二氯甲烷/石油醚);IR(KBr)3300cm-1;1H NMR(DMSO-d6)4.56 (bs,2H),6.66(t,1H,J=3.2Hz),7.03(m,2H),7.18(dd, 1H,J=10.6,2.7Hz),8.02(dd,1H,J=8.9,5.6Hz),8.15 (s,1H),8.87(bs,1H).分析计算值C11H9FN4:C,H,N.

1H-吡略-2-羧酸N’-吡略并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼-1(SC141)。将在无水THF(10mL)中的吡咯-2-羧酰氯(58mg,0.45mmol) 和三乙胺(1mL)混悬液逐滴加入搅拌的在无水THF(3mL)中的化合物 14a(90mg,0.45mmol)的溶液中。将混合物在室温搅拌过夜。将蒸 发除去挥发物后的残留物在乙酸乙酯和水之间进行分配。分离有机层 并与盐水一起振摇并干燥。蒸发溶剂得到为白色固体的化合物1(82mg, 62%产率);mp 210-212℃(甲醇);IR(KBr)3255,1675cm-1;1H NMR (DMSO-d6)6.14(s,1H),6.77(t,1H,J=3.1Hz),6.99(s,1 H),7.13(d,1H,J=3.7Hz),7.25(m,2H),7.42(m,2H),8.06 (m,1H),8.27(m,1H),9.32(bs,1H),10.11(bs,1H)11.58 (bs,1H).MS(CI)m/z 292(MH+).分析计算值C16H13N5O:C,H,N。

太阳城集团烟酸N’-吡略并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼2(SC142)。将固体烟 酰氯盐酸盐(155mg,0.90mmol)逐滴加入搅拌的并且冰冷的在无水 吡啶(15mL)中的4-肼基吡咯并[1,2-a]喹_啉14a(200mg,1.01mmol) 的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。在常规检查后,得到为浅黄 色固体的化合物2(122mg,产率40%);mp 237℃(甲醇/乙酸乙酯); IR(KBr)3245,1680cm-1;1H NMR(DMSO-d6)6.70(m,1H),7.07 (m,1H),7.18(m,2H),7.36(m,1H),7.48(m,1H),7.98(m, 1H),8.20(m,2H),8.69(m,1H),9.05(m,1H),10.75(bs, 1H),11.80(bs,1H).MS(CI)m/z 304(MH+).分析计算值C17H13N5O: C,H,N.

吡嗪-2-羧酸N’-(7,8-二甲基吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基)-酰肼3(SC143)。在1h内向搅拌的在无水二氯甲烷(2mL)中的2-吡嗪 羧酸(62mg,0.50mmol)的混悬液中逐份(portion wise)加入三苯 基膦(262mg,1.00mmol)和2,2′-二硫基联吡啶(220mg,1.00mmol)。 当起始物料消失时(TLC)加入在同样的溶剂(6mL)中的4-肼基-7,8- 二甲基吡咯并[1,2-a]喹_啉14b(113mg,0.50mmol)的溶液,然后 将所得混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂并将残留物在乙酸乙酯和 水之间分配。分离有机层并与盐水一起振摇并干燥。将蒸发溶剂后所 余残留物通过快速色谱法(氯仿∶甲醇∶氢氧化铵,89∶10∶1)纯化得到 为浅黄色固体的化合物3(63mg,产率38%);mp 116℃(甲醇/乙酸 乙酯);IR(KBr)3250,1675 cm-1;1H NMR(DMSO-d6)3.35(s,6H), 6.74(t,1H,J=3.8Hz),7.31(d,1H,J=3.8Hz),7.42(m, 1H),7.64(m,2H),7.87(bs,1H),8.28(bs,1H),8.71(s, 1H),8.87(m,1H),9.20(s,1H).MS(CI)m/z 333(MH+).分 析计算值C18H16N6O:C,H,N。

吡嗪-2-羧酸N’-(7-氟吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基)-酰肼4(SC144)。按照与化合物3所述相同的方法,但是使用7-氟-4-肼基吡咯 并[1,2-a]喹_啉14c(108mg,0.50mmol),得到浅黄色的固体化合 物4(56mg,产率35%);mp 196℃(甲醇/乙酸乙酯);IR(KBr)3255, 1690cm-1;1H NMR(DMSO-d6)6.75(m,1H),7.15(m,1H),7.37 (bs,1H),7.61(m,2H),8.15(m,1H),8.31(m,1H),8.87 (s,1H),8.97(m,1H),9.26(s,1H),11.50(bs,1H,exch. with D2O).MS(CI)m/z 323(MH+).分析计算值C16H11FN6O:C,H,N。

N′-咪唑并[1,2-a]吡啶并[3,2-e]吡嗪-6-基吡嗪-2-碳酰肼5(SC148)。按照与化合物3所述相同的方法,但是使用6-肼基咪唑并 [1,2-a]吡啶并[3,2-e]吡嗪14d(100mg,0.50mmol),得到为浅黄 色固体的化合物5(38mg,产率25%);mp 271℃(甲醇);IR(KBr) 3250,1675cm-1;1H NMR(DMSO-J6)7.52(m,1H),7.76(s,1H), 8.02(m,1H),8.41(s,1H),8.57(s,1H),8.85(s,1H),8.96 (s,1H),9.26(s,1H),10.76(bs,1H),13.93(bs,1H).MS (CI)m/z 307(MH+).分析计算值C14H10N8O:C,H,N。

制备化合物6-9(SC 155-158)的一般方法。描述作为代表性实施 例的1H-吲哚-2-羧酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼6(SC155) 的制备。

在15分钟内向搅拌的在乙酸乙酯(15mL)的EDC(94mg,0.49 mmol)和DMAP(cat.)溶液中逐份加入化合物14a(77mg,0.39mmol) 和2-吲哚羧酸(63mg,0.39mmol)。将所得混合物在室温搅拌24小 时,然后与碳酸氢钠饱和溶液和水一起振摇。蒸发干燥的萃取物得到 残留物,将其结晶得到为白色固体的化合物6(82mg,产率62%);mp 186℃(二氯甲烷/石油醚);IR(KBr)3255,1680cm-1;1H NMR(DMSO-d6) 6.75(s,1H),7.05(m,1H),7.20(m,4H),7.40(m,3H),7.65 (m,1H),8.10(m,1H),8.35(s,1H),9.55(bs,1H),10.65 (bs,1H),11.80(bs,1H).MS(CI)m/z 342(MH+).分析计算值 C20H15N5O:C,H,N。

1H-吲哚-5-羧酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼7(SC 156)。按照与化合物6所述相同的方法,但是使用2-吲哚羧酸(63mg,0.39 mmol),得到为白色固体的化合物7(69mg,产率52%);mp 160℃(二 氯甲烷/石油醚);IR(KBr)3250,1680cm-1;1H NMR(丙酮-d6)6.60 (d,1H,J=3.6Hz),6.75(t,1H,J=3.6Hz),7.23(d,1H, J=3.6Hz),7.29(m,2H),7.51(m,3H),7.85(d,1H,J= 8.5Hz),8.03(m,1H),8.20(m,1H),8.39(s,1H),9.60(bs, 1H),10.70(bs,1H),11.45(bs,1H).MS(CI)m/z 342(MH+). 分析计算值C20H15N5O:C,H,N。

太阳城集团1H-吲哚-6-羧酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼8(SC157)。按照与化合物6所述相同的方法,但是使用6-吲哚羧酸(63mg, 0.39mmol),得到为白色固体的化合物8(17mg,产率13%);mp 198.5 ℃(二氯甲烷/石油醚);IR(KBr)3245,1685cm-1;1H NMR(丙酮-d6) 6.55(m,1H),6.85(m,1H),7.28(m,1H),7.28(m,3H),7.45 (m,1H),7.60(d,1H,J=8.1Hz),8.70(m,2H),8.15(s, 1H),8.39(m,1H),9.44(bs,1H),10.55(bs,1H),11.51(bs, 1H).MS(CI)m/z 342(MH+).分析计算值C20H15N5O:C,H,N。

太阳城集团1H-吲哚-3-羧酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼9(SC158)。按照与化合物6所述相同的方法,但是使用3-吲哚羧酸(63mg, 0.39mmol),得到为白色固体的化合物9(42mg,产率32%);mp 162.5 ℃(二氯甲烷/石油醚);IR(KBr)3250,1685cm-1;1H NMR(CDCl3) 6.80(m,1H),6.90(t,1H,J=3.3Hz),7.08(d,1H,J=3.2 Hz),7.30-7.60(m,4H),7.48(m,1H),7.58(m,1H),7.90(m, 2H),8.10(m,1H),8.11(s,1H),8.30(m,1H),9.20(bs, 1H),10.25(bs,1H),11.60(bs,1H).MS(CI)m/z 342(MH+). 分析计算值C20H15N5O:C,H,N。

制备化合物10和11(SC153和SC154)的一般方法。通过缩合步骤, 使用与先前化合物所述相同的EDC/DMAP过程但是使用适合的N-BOC- 氨基酸,随后脱保护来完成化合物10和11的制备。

太阳城集团四氢噻唑-4-羧酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼10(SC153)。由N-BOC-四氢噻唑-4-羧酸(90mg,0.39mmol)起始,获得为 固体的叔丁基4-[(2-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-肼基)羰基]-1,3- 四氢噻唑-3-羧酸酯,结晶后(己烷),在随后的水解步骤中直接使用。 在0℃将得到的固体加入到搅拌的TFA(2mL)和苯甲醚(2mL)的混合 物中。使反应混合物达到室温并搅拌另外50分钟。通过与甲苯(3x3 mL)共沸蒸馏蒸发挥发物得到为浅黄色固体的化合物10(66mg,基于 14a产率为55%);mp 162℃(乙酸乙酯/己烷);IR(KBr)3255,1690 cm-1;1H NMR(甲醇-d4)3.15(dd,1H,J=10.9,4.9)3.30(dd, 1H,J=10.9,7.1Hz),4.11(0.5 of ABq,1H,J=9.7Hz),4.25 (0.5 of ABq,1H,J=9.7Hz),4.45(dd,1H,J=7.1,4.9Hz), 6.92(m,1H),7.41(m,3H),7.71(d,1H,J=7.4Hz),8.09 (d,1H,J=9.3Hz),8.38(m,1H),10.40(bs,1H),11.20(bs, 1H).MS(CI)m/z 314(MH+).分析计算值C15H15N5OS:C,H,N。

3-氨基-丙酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼11(SC 154)。按照与化合物10所述相同的方法,但是使用N-BOC-β-丙氨酸(74mg, 0.39mmol),得到为白色固体的化合物11(92mg,基于14a产率为 88%);mp 164.5℃(二氯甲烷/石油醚);IR(KBr)3255,1680cm-1; 1H NMR(DMSO-d6)2.80(m,2H)3.20(m,2H),7.05(m,1H),7.50 (m,2H),7.95(m,2H),8.30(m,1H),8.60(m,1H),10.70 (bs,1H),11.25(bs,1H).MS(CI)m/z 270(MH+).分析计算值 C14H15N5O:C,H,N.

太阳城集团N,N’-双-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-碳酰肼12(SC147)。将在乙 醇(2mL)中的肼一水合物(22μL,0.45mmol)和乙基吡咯并[1,2-a] 喹_啉-4-羧酸酯15(216mg,0.90mmol)的混合物加热回流3h。将蒸 发溶剂后得到的残留物通过色谱法进行纯化(二氯甲烷∶乙酸乙酯, 9∶1)得到为白色固体的化合物12(115mg,产率62%);mp 138-139 ℃(乙酸乙酯/己烷);IR(KBr)1680cm-1;1H NMR(DMSO-d6)6.28 (d,2H,J=1.7Hz),7.01(d,2H,J=1.7Hz),7.45(m,8H), 7.95(d,2H,J=7.5Hz),9.95(bs,1H),10.80(bs,1H).MS (CI)m/z 421(MH+).分析计算值C24H16N6O2:C,H,N。

3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼(SC160)。向搅拌的在乙酸乙酯(15mL)中的EDC(94mg,0.49mmol) 和DMAP(cat.)溶液中,在15分钟的太阳城集团内逐份加入4-肼基吡咯并 [1,2-a]喹_啉14a(77mg,0.39mmol)和Boc-3-氨基-3-(2-氯苯基) 丙酸(78mg,0.39mmol)。将所得混合物在室温搅拌24h,然后与碳 酸氢钠饱和溶液和水一起振摇。蒸发干燥萃取物得到残留物,将其通 过结晶进行纯化并用于随后的水解步骤而没有做进一步鉴定。在0℃ 将所得固体加入搅拌的TFA(2mL)和苯甲醚(2mL)的混合物中。使反 应混合物达到室温并搅拌另外50分钟。通过与甲苯(3x3mL)共沸蒸 馏蒸发挥发物得到为固体的标题化合物。

喹_啉-2-羧酸N’-吡咯并[1,2-a]喹_啉-4-基-酰肼(SC 173)。在1h内向搅拌的在无水二氯甲烷(2mL)中的2-喹_啉羧酸(87mg, 0.50mmol)混悬液中逐份加入三苯基膦(262mg,1.00mmol)和2,2′- 二硫基联吡啶(220mg,1.00mmol)。当起始物料消失时(TLC)加入 在同样的溶剂(6mL)中的4-肼基吡咯并[1,2-a]喹_啉14a(100mg, 0.50mmol)的溶液,然后将所得混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂 并将残留物在乙酸乙酯和水之间分配。分离有机层并与盐水一起振摇 并干燥。将蒸发溶剂后所余残留物通过快速色谱法得到为固体的标题 化合物。

太阳城集团烟酸N’-9H-吡咯并[1,2-a]吲哚-9-基-酰肼(SC 175)。将固体 烟酰氯盐酸盐(155mg,0.90mmol)逐份加入搅拌的并且冰冷的在无水 吡啶(15mL)中的9-肼基-9H-吡咯并[1,2-a]吲哚(187mg,1.01mmol) 的溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。在蒸发挥发物后,分离得到 为固体的标题化合物,通过柱色谱法或结晶对其进行纯化。

SC144对一组激素依赖性和非依赖性细胞株显示出显著的效力。

太阳城集团通过MTT试验对一组7种人癌细胞株对SC144的敏感性进行了评 价。SC144显示出极好的活性,CC50剂量范围为0.7至10uM(表1)。 对SC144的敏感性是太阳城集团和剂量依赖性的。在这些细胞株中的SC144 的敏感性似乎与HR、p53、pRb、p21和p16的状态无关(表1)。在HEY 细胞株中SC144显示出显著的活性(CC50=1.0±0.06uM),因为这 种细胞似乎实际上对卵巢癌中最常使用的药物顺铂耐受。此外,SC144 在HEY细胞株中的效力是前列腺癌PC3细胞株的10倍(CC50=10.0± 0.2uM)。在SC144还在HR阳性(MCF-7和MDA-MB-468)和阴性 (MDA-MB-435)人乳癌细胞中表现出良好的活性。令人感兴趣地是,ER+ 细胞对SC144的敏感性是ER-细胞株(MDA-MB-435,CC50=4.0±1.4uM) 的5.5倍(MDA-MB-468,CC50=0.7±0.1uM)和2.3倍(MCF-7,CC50=1.7±0.3uM)(表1)。

太阳城集团表1.前列腺癌、乳癌和卵巢癌细胞株对SC144的敏感性

  细胞株   来源     bHR   p53   pRb     p16     P21   aCC50值   (平均±SD)   SC144(μM)   PC3   DU145   HEY   MCF-7   MCF-7/ADR   MDA-MB-435   MDA-MB-468   前列腺癌   前列腺癌   卵巢癌   乳癌   乳癌   乳癌   乳癌     AR-     AR-     AR+     ER+     ER-     ER-     ER-   Null   Mut   WT   WT   Mut   Mut   Mut   WT   Null   ND   WT   WT   WT   Nu11     WT     Mut     WT     WT     ND     WT     ND     WT     Mut     ND     WT     WT     WT     WT   10±0.2   3.0±0.3   1.0±0.1   2.0±0.3   2.5±1.0   4.0±0.1   0.7±0.1

太阳城集团aCC50定义为引起细胞群体50%减少的药物浓度;bHR:激素受体; AR:雄激素受体;ER:雌激素受体;WT:野生型;Mut:突变株;ND: 未测定。HEY细胞对顺铂耐受并且MCF/ADR对阿霉素耐受。

SC144处理诱发S期阻滞。

太阳城集团在HEY和MDA-MB-435细胞中研究了由SC144诱发的细胞周期干 扰。通过流式细胞术对DNA谱的分析表明与喜树碱(CPT)相当,SC144 诱发S期阻滞。如图1所示,使用SC144(3uM)处理24小时后,80% 的细胞保持在S期。在异步(asynchronus)前列腺癌细胞株DU145 中得到相似的结果。在暴露于SC144的第24小时观察到最大阻滞,持 续至第48h。SC144诱发细胞周期阻滞的这种性质使得其是与作用于细 胞周期不同阶段的其他药物例如紫杉烷进行组合治疗的理想药物。

SC144处理诱发凋亡。

太阳城集团在凋亡细胞死亡中的早期事件是磷脂酰-丝氨酸残基易位至细胞 膜外部。这个事件先于核分裂、DNA断裂、与凋亡最相关的分子的出 现,可容易地通过膜联蛋白V结合试验进行测量。通过该方法,将SC144 与CPT进行了比较。如图2所示,与CPT相比,SC144引起了非常强 烈的与CPT诱导相当的凋亡效果。在用SC144和CPT处理的第48h处 理细胞中早期凋亡细胞百分数分别达到37%和34%。在第48小时还观 察到两种化合物的凋亡/坏死晚期的增加(对于SC144和CPT分别为 16%和39%)。

太阳城集团SC144在小鼠异种移植模型中显示出体内有效性。

太阳城集团在裸小鼠人乳癌MDA-MB-435细胞异种移植模型中对SC144的体内 有效性进行了评估。图3A显示了实验程序的示意图。每天i.p.注射 盐水(对照)0.3mg/kg、0.8mg/kg和4mg/kg和SC144对动物进行 治疗。在给药5天后,中断药物治疗,每周两次对动物进行检测,持 续5周。图3B显示了SC144治疗的MDA-MB-435异种抑制模型的经时 体积(平均±SD)。

太阳城集团为了统计分析,在给药最后一天计算%T/C值并对所有治疗组作图 (图3C)。在乳癌异种移植模型中以最低剂量SC144观察到局部减少 (marginal reduction)。在更高SC144剂量观察到肿瘤生长显著减 少。在4mg/kg时SC144减少肿瘤生长60%。图4A显示了在研究结束 时使用和没有使用SC144进行治疗的小鼠代表性的图像。尽管在对照 小鼠中,肿瘤块变成大块,在胸腔周围蔓延,浓密地血管化,但是SC144 治疗的肿瘤大小显著减少,血管化不充分,保留在局部(图4,B和C)。 使用SC144的治疗能够被很好耐受并且不会导致药物相关的死亡。而 且与载体对照相比使用SC144没有观察到体重的任何变化。

将该研究扩大至其它细胞株。发现在非小细胞性肺癌细胞HOP- 62、EKVX和HOP-92中SC144显示出纳摩尔(nanomolar)效力。CC50值的范围为10-20nM,效力为大约MDA-MB-435细胞株的400倍(表2)。 在HCT-116和HT29结肠癌细胞株(表2)观察到亚纳摩尔至低纳摩尔的 效力。

表2.各种癌细胞对SC144的敏感性

细胞株     来源     CC50(uM) HOP-62 HOP-92 EKVX HL60 RPMI-8226 SF-268 SF-295 UACC-257 UACC-62 SKOV3 UO-31 HCT-116 HT29     非小细胞肺癌     非小细胞肺癌     非小细胞肺癌     白血病     白血病     CNS癌     CNS癌     黑色素瘤     黑色素瘤     卵巢癌     肾癌     结肠癌     结肠癌     0.01     0.2     0.01     0.27     0.25     0.3     0.42     0.4     0.8     0.12     0.3     0.017     0.078

太阳城集团SC144诱发体内选择性和显著的肿瘤坏死。

为了评估药物治疗后肿瘤坏死的程度在第70天从对照和治疗小 鼠收集肿瘤样品。图5显示了由代表性小鼠获得的肿瘤样品的H&E染 色。一般而言,观察到80%以上使用4mg/kg的SC144治疗的肿瘤组 织坏死(图5B)。

SC144没有呈现全身毒性。

太阳城集团为了评价SC144全身毒性的可能性,用显微镜对几种器官进行了 检查。图6显示注射4mg/kg的SC144治疗的小鼠肾脏、肝脏和心脏 组织的代表性的H&E染色。在肾脏中没有观察到肾小球或肾小管坏死 (图6A)。在肝脏中没有观察到显著的病理学状态。图6B显示肝细 胞束是正常的。最后,心肌是正常的并且没有观察到可检测的损伤(图 6C)。总之,H&E染色结果表明每组代表性小鼠的这些器官中没有损 伤。

太阳城集团SC144以其抗肿瘤活性相关的浓度不会抑制细胞色素P450酶。

研究潜在候选药物对细胞色素P450酶的抑制有助于预测给药时 产生的药物-药物相互作用和/或不利的PK曲线。由重要的细胞色素 P450酶介导的药物代谢的竞争抑制可能会导致血浆药物浓度不需要 的升高,血浆药物浓度对于治疗和毒理学原因具有临床重要性。为了 测定SC144是否抑制人细胞色素P450酶催化活性,与已知的对照底物 酮康唑相比进行了对CYP3A4特异的体外试验(图7)。这些结果提示 SC24,一种SC144的类似物,不会显著抑制CYP3A4活性,但是SC144 的IC50值范围为8-20μM,,提示对某些CYP3A4的抑制活性。但是这 种浓度高于其抗肿瘤有效浓度。

监测肿瘤对SC144的反应。

[18F]FDG是当前使用最广泛的与PET一起成像肿瘤学治疗反应的 放射性示踪剂。PET/[18F]FDG测量肿瘤中存活的细胞浓度并且还提供 有关葡萄糖转运体和己糖激酶活性表达的太阳城集团。使用C-11标记的FMAU (半衰期20分钟)也可有效的与PET用于成像肿瘤细胞分裂(Bading 等(2004)Nucl.Med.Biol.31:407-418)。在细胞摄取后,FMAU被 胸苷激酶磷酸化并被结合入DNA。使用这种技术的初步研究表明其非 常适合于跟踪SC144在鼠人肿瘤异种移植模型中的效果。

太阳城集团基线,平衡相FDG扫描显示在小鼠右肩(箭头)有存活的肿瘤。 在(图8B)早期,FMAU显示了肿瘤周围的“热”边缘(″hot″rim), 提示有灌注不足的中心。在后面第30分钟和60分钟的图像中(图8C), FMAU充满整个肿瘤,表明分裂细胞到处存在。

图8D-F显示在治疗5天后对同样小鼠进行重复研究。FDG扫描显 示肿瘤生长显著(测量体积在两倍以上),但是此时具有坏死中心, 与在基线FMAU研究中观察到的灌注不足一致。FMAU扫描(图8E)显 示在10分钟完全灌注不足的肿瘤。但是,到60分时肿瘤几乎被FMAU 充满,提示全部肿瘤存在分裂细胞。用卡钳测量小鼠肿瘤大小5周, 与伪治疗组的对照小鼠相比显示肿瘤体积显著(>50%)的长期的减小。

太阳城集团初步的研究证明在使用SC144治疗的异种移植小鼠中可使用 [18F]FDG和[11C]FMAU进行连续microPET研究。令人感兴趣地是,已 经观察到使用SC144 5天似乎抑制了肿瘤灌注,提示具有可能的抗血 管生成效果。

太阳城集团SC化合物与已知机制的药物的比较

选择六种已知作用机制和细胞周期调节机制的药物(表3)与三 种SC化合物进行比较。最初在持续暴露于药物48小时下使用MTT试 验来测定所有这些药物的50%和80%细胞毒浓度CC50和CC80的值(表3)。 对于基因表达分析,使用CC80的药物处理MDA-MB-435细胞(1x106)24 小时。选择24小时的CC80值作为单一的浓度和单一的太阳城集团点,这是由 于使用Real-Time PCR研究进行基因表达分析的先前经验,发现在该 条件下相当数量的基因对治疗的响应始终如一并且改变可重复。目标 是鉴别基因表达改变的模式,其是不同药物种类的特征,不同于与凋 亡或非凋亡细胞死亡相联系的最终共同途径改变的模式。

太阳城集团表3.在该研究中使用的药物的活性和特性

药物 作用机制 细胞周期特性 CC50(uM) CC80(uM) SC144 未知 S-期 4±1.4 10±0.01 SC23 未知 G0/G1和S-期 0.04±0.007 0.1±0.01 SC24 未知 G0/G1 0.24±0.03 0.97±0.15 鬼臼乙叉甙 拓扑异构酶II抑制剂 G2/M 52.5±3.5 300±106 米托蒽醌 拓扑异构酶II抑制剂 G2/M 4.5±1.4 7.3±0.35 喜树碱 拓扑异构酶II抑制剂 S和G2/M 0.03±0.002 0.1±0.002 顺铂 DNA烷化剂 39±1.41 71±1.4 紫杉醇 微管稳定剂 M-期 0.04±0.003 0.07±0.01 5-氟尿嘧啶(5FU) 胸苷酸合成酶抑制剂 S-期 29±10.7 100±0.01

生物太阳城集团分析.

太阳城集团为了构建基因表达分析谱,使用57,000 Affymetrix GeneChip (U133+2)阵列使用和没有使用药物治疗进行了两个独立的试验。表达 值被截止到10以下,并进行log转换。最初的过滤除去10%以上样品 中表达值小于50的所有基因:在该阈值以下,“噪音”基本在估计值 中并且许多显示这样的低值的基因可能根本没有表达。对于给定的基 因,由于10%为非常低的表达者,可以仅在单一组(例如对照组)中 包括那些未表达的基因。通过观察重复试验之间高度相关性证实了数 据的可重复性(图9A和图9B)。两次试验之间的紧密的相关性的结 果是倾向于将这些样品分类在一起(参见图10)。

为了鉴别处理样品中基因显著地向上或向下调节(与对照相比) 对每种基因进行了T-检验并且将相对于平均log表达差异的t-统计学 作图(图9C)。根据该图,可以鉴别以给定的p阈值同时具有统计学 显著意义并且显示出在规定值以上的倍数变化的基因。可选地,选择 p-值的截止值以产生一组具有预先确定的错误发现率的基因。

获得了在暴露于具有已知作用模式的六种药物之后基本上(10 倍)向上或向下调节的基因列表(参见表4,SC144调节基因)。将列 表组合产生了753种的一组基因,期望其能区别具有已知作用机制的 六种药物。对于全部14个观察(三种SC化合物,加上6种已知药物 重复两次,被分析的两种重复两次)这些基因的主成分分析显示倾向 于相对紧密地将重复的分类到一起,两种拓扑异构酶II抑制剂形成一 组,其它已知药物形成第二组,三种SC化合物组成不同的第三类(图 10A)。

太阳城集团表4.最显著基因的列表,p<0.0001并且相对于对照SC144的倍数 变化至少为2。

基因名称  倍数变化     p-值 小分子富脯氨酸蛋白1A 在骨骼肌中过量表达的GTP结 合蛋白 白细胞介素24 sestrin 2 假定蛋白MGC4504 细胞周期蛋白依赖性蛋白激 酶抑制剂1A(p21) 早期生长应答1 ATP酶、H+转运、溶酶体38kDa、 V0亚型d同工型2  28.28  25.84  25.83  25.73  24.88  19.81  17.89  12.81     0.00002     0.00003     0.00008     0.00005     0.00002     0.00001     0.00006     <0.00001

AXIN1向上调节1 双重特异性磷酸酶5 超氧化歧化酶2、线粒体 肝素结合表皮生长因子样生 长因子 A分解蛋白和金属蛋白酶域 19(融合素β) 内皮PAS域蛋白1 肌醇1,4,5-三磷酸酯受体,1 型 组织因子通道抑制剂(脂蛋白 结合的凝固抑制剂) 纤维蛋白原、γ多肽 RAB20、RAS致癌基因族成员 蛋白激酶,AMP-活化,γ2非 催化亚单位 制瘤素M受体 组织蛋白酶B B细胞抑制剂中的核素κ轻多 肽基因增强子的核因子,α BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互 作用蛋白3 整联蛋白,β3(血小板糖蛋 白IIIa,抗原CD61) 双重特异性磷酸酶10 细胞周期调节蛋白SDP35 plexin C1 小眼球结合转录因子 钙激活蛋白酶小亚型2 12.45 11.65 11.52 9.62 8.5 6.59 5.96 5.4 4.9 4.87 4.78 4.36 3.89 3.78 3.63 3.35 3.3 0.19 0.19 0.16 0.14   <0.00001   <0.00001   <0.00001   0.00008   0.00003   0.00005   0.00005   <0.00001   <0.00001   <0.00001   0.00001   0.00008   0.00002   <0.00001   0.00006   <0.00001   <0.00001   0.00002   0.00003   0.00009   0.00007

假定蛋白DKFZp434L142     0.07     <0.00001

这种模式被基于所有基因的分级聚类分析(距离度量:相关性;方 法:计算两类各点之间平均距离作为类距离)所支持,将分离地SC化合 物聚集在一起(图10B)。这提供了支持如下假说的证据,即SC药物 具有不同的作用机制,产生不同的下游分子作用于细胞,因此影响其 基因表达谱。有许多基因被鉴别为具有不同于与凋亡或非凋亡细胞死 亡相联系的最终共同途径变化的模式。这进一步说明基因表达某些模 式的变化是不同类药物的特征并且通过生物太阳城集团工具能够被非特异性 (例如应激敏感性)基因所识别。

太阳城集团将表4基因的属性(基因本体代码,蛋白分类,途径成员 (pathway membership))与设定用于确定最能够描述该组基因的特性 的特征的全部数据的属性进行比较(图11)。

根据该分析,可以研究具有有利特定特性的基因亚组。这样的一 个组是具有EGF样域的基因组(如InterPro分类)。图12显示使用 GenetrixTM的基因列表。

太阳城集团另一种有利的种类是″Subset″种类,其代表用户定义的基因分类。 为了该分析,对于每种药物使用向上或向下调节至少10倍的基因组以 产生六种这样的类别。从图13可以看到在与SC144治疗相联系的基因 和″鬼臼乙叉甙″亚组之间存在显著重叠,在两列表之间有19种基因相 同(优势比16.1,p<0.0001)。

考虑全部六种基因更详细的分析(图14)显示使用米托蒽醌和CPT 也有显著的重叠。

太阳城集团总之,这些结果表明虽然SC144具有一些拓扑异构酶抑制剂的特 征(尤其是在向上或向下调节10倍或更多的基因中),但是全部三种 SC化合物分类不同于拓扑异构酶抑制剂,提示这些药物具有不同的作 用模式。

实施例II

我们建立了有10,000种报道的和获得专利权的整合酶抑制剂的 化合物的数据库,在一些情况下其可能靶向于甚至比整合酶更有强的 另外的DNA处理酶。使用该数据库,我们开发了各种药效基团模型, 随后使用ADMET Predictor软件包(Simulations Plus,Inc., Lancaster,CA)和聚类分析进行毒性预测以将大部分抗病毒化合物与 细胞毒化合物分开。基于这些药效基团模型,在我们抗癌药物发现计 划中包括了我们所鉴别的作为可能的先导化合物的水杨酰肼类化合 物。为了继续开发这类化合物,我们搜索了我们内部的多构象数据库 的~4500,000种化合物并鉴别了>2,200种的具有共同结构特征和药 效基团片段的化合物。然后我们由商业来源获得950种类似物并通过 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑_细胞毒性试验对其 进行初步筛选,然后深入地试验了专有的衍生物。对于另外740种不 满足我们ADMET计算要求的化合物没有进行试验。

太阳城集团在本文,我们提供了18种化合物的体外活性曲线并且聚焦在两种 化合物SC21和SC23,对其进行了详细分析。我们的结果表明SC21和 SC23在一组肿瘤细胞株,包括雄激素受体阳性和阴性前列腺癌细胞, 雌激素受体阳性和阴性乳癌细胞以及本身耐受顺铂的卵巢癌细胞株显 示出显著的活性。另外,我们测试了SC21对细胞周期调节和凋亡的效 果并且评估了SC21在人前列腺癌异种移植模型中的体内治疗潜力。

材料和方法

细胞培养

人前列腺癌细胞(PC3,p53 null,AR-;DU145,p53突变体,AR-; 和LNCaP,p53野生型,AR+)和乳癌细胞(MCF-7,过度表达的野生型 p53,ER+;MDA-MB-468,p53突变体,ER+;和MDA-MB-435,p53突 变体,ER-)由美国菌种保藏中心获得(Manassas,VA)。天然耐受顺铂 (CDDP)的人卵巢癌细胞(HEY)株由Dr.Dubeau(University of Southern California Norris Cancer Center;Buick等人(1985) Cancer Res.45:3668-76和Hamaguchi等人(1993)Cancer Res. 53:5225-32)馈赠。CEM细胞的结果先前有记载(Neamati等人(1998)J. Med.Chem.41:3202-9)。在添加有10%胎牛血清(Gemini-Bioproducts, Woodland,CA)和2mmol/L L-谷酰胺的RPMI 1640中在5%CO2的潮湿 气氛中在37℃保持细胞单层培养。为从烧瓶中取出粘附细胞进行传代 和计数,使用不含钙或镁的PBS洗涤细胞,于小体积的0.25%胰蛋白 酶-EDTA溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)温育5至10分钟,用 培养基洗涤并离心。所有试验使用处于指数细胞生长期的细胞进行。

药物

使用DMSO制备所有化合物的10mmol/L的储备溶液并在20℃度贮 存。进一步的溶液用PBS新鲜制备。

细胞毒性试验

太阳城集团按先前所述(Carmichael等人(1987)Cancer Res.47:936-42), 通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑_试验对细胞 毒性进行评价。简要地,将细胞接种在96孔微量滴定板上(PC3和DU145 为5,000细胞/孔和LNCaP为10,000细胞/孔;乳癌和卵巢细胞4,000 细胞/孔)并使其粘附。随后持续暴露于相应的化合物72小时来处理 细胞。向每孔中加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 _溶液(终浓度0.5mg/mL)并在37℃将细胞温育4小时。除去培养 基后,加入DMSO并在570nm读取吸光度。所有试验重复三次。然后由 log(药物浓度)相对于细胞杀灭百分数作图测定每种药物的IC50。

细胞周期分析

太阳城集团通过碘化丙啶DNA染色对SC21和喜树碱(CPT)诱发的细胞周期 干扰进行了分析。简要地,使用不同剂量的药物处理指数生长的PC3 和DU145细胞24,48和72小时。在每次处理太阳城集团结束时,收集细胞 并在以200xg缓缓离心5分钟后用PBS进行洗涤。将细胞在0.5mLPBS 中完全重新悬浮并在70%乙醇中4℃固定至少2个小时。然后以200xg 离心乙醇悬浮的细胞5分钟并用PBS洗涤两次以去除残余的乙醇。对 于细胞周期分析,将团粒在含有0.02mg/mL碘化丙啶,0.5mg/mL无 DNA酶的RNA酶A和0.1%Triton X-100的1mL PBS中悬浮并在37℃ 温育30分钟。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose, CA)获得细胞周期特性并通过ModFit LT软件(Verity Software House, Inc.,Topsham,ME)对数据进行分析。

凋亡试验

太阳城集团为了定量药物诱发的凋亡,进行膜联蛋白V/碘化丙啶染色,随后 进行流式细胞术。简要地,在药物处理后(IC80,每种药物72小时), 将漂浮细胞和粘附细胞合并使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒 (Oncogene Research Products,San Diego,CA)根据制造商提供的 试验方案对其进行膜联蛋白V/碘化丙啶染色。未处理的对照细胞 (24-72小时)与药物处理组保持平行。在经历凋亡的细胞中,膜联蛋 白V与磷脂酰丝氨酸结合,其从细胞质膜的内部易位至外部。使用双 重染色以区别存活的、早期的凋亡与坏死或晚期凋亡细胞(Fadok等人 (1992)J.Immunol.148:2207-16)。通过流式细胞术使用FACScan 流式细胞仪(Becton Dickinson)测定所得荧光(绿色荧光,FLH-1通 道;红色荧光,FLH-2通道)。根据该方法,左下象限显示存活的细胞, 左上象限显示细胞碎片,右下象限显示早期凋亡细胞和右上象限显示 晚期凋亡和坏死细胞。

动物

使用五十只雄性无胸腺裸(nu/nu)小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)进行体内测试。动物随意进食并保 持在装有空气调节设备的房间中,温度20±2℃,12小时明暗交替。根 据与实验动物护理和使用指南一致的南加利福尼亚大学机构指南 (University of Southern California Institutional Guidelines) 对动物进行护理和处理。

太阳城集团肿瘤异种移植的药物治疗

在无菌条件下将得自体外细胞培养的PC3细胞经皮下接种至无胸 腺裸小鼠的肋腹(2x106细胞/肋腹)。通过使用Vernier卡钳每周测 量肿瘤直径(长x宽)两次来评价肿瘤的生长。根据以下公式计算肿瘤 重量:TW(mg)=肿瘤体积(mm3)=d2xD/2,其中d和D分别是最短 和最长的直径。使细胞生长至平均体积100mm3。然后将动物随机分为 对照组和治疗组,接受载体或SC21(0.3和3mg/kg,溶解于等渗盐水 溶液中),通过i.p.注射5天,每天一次。每只动物的治疗基于个体 重量。治疗5天后,每周测量每组的肿瘤体积一次,测量4周。每天 检查治疗动物的治疗毒性/死亡率。按%T/C=100x(治疗组平均TW/ 对照组平均TW)计算肿瘤生长抑制百分数。

计算ADMET分析

太阳城集团建立了所有化合物的结构并使用Catalyst软件包(Accelrys, Inc.,San Diego,CA)将其减到最少。在Catalyst的Catconf模块 内使用最佳的构象产生方法产生在20kcal/mol能量范围内的每种化 合物可能的唯一的构象。所有化合物的低能量构象异构体被输出到 Accord(Accelrys)以计算A log P 98和快极性表面积。还可以使用 ADMET Predictor(Simulations Plus)计算log P值。如先前所述 (Egan等人(2000)J.Med.Chem.43:3867-77和Egan和Lauri(2002) Adv.Drug Deliv.Rev.54:273-89)使用化合物的A log P 98和快 极性表面积值构建人肠吸收曲线。

统计学分析

测定进行三次,将结果表示为平均±SD。通过双侧配对t检验,使 用95%置信区间进行统计学分析和确定P值以确定治疗组之间的显著 性差异。P<0.05被认为是显著的。使用ANOVA以检验所有组之间的 显著性。使用SAS统计软件包(SAS Institute,Gary,NC)进行统计 分析。

结果

根据里宾斯基五规则选择化合物

使用药效基团模型,毒性预测和归类由>2,200种化合物进行选 择,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑_细胞毒性 试验对选择的950种化合物进行评估。18种化合物对一组不同来源的 癌细胞株呈现出优良的活性曲线。在表5中列出了这些化合物的结构、 理化性质和细胞毒性。所有化合物满足里宾斯基五规则。该规则基于 对源于世界药物索引数据库(World Drug Index database)的2,245 种药物的分析,~90%推向市场的药物具有:(a)分子量<500,(b)C log P<5,(c)氢键供体(O-H和N-H的总和)<5,(d)氢键受体(N和O原 子的总和)<10(Lipinski等(1997)Adv.Drug Deliv.Rev. 23:3-25).

表5.水杨酰肼的物理化学性质和细胞毒性

表5.水杨酰肼的物理化学性质和细胞毒性(Cont′d)

全部18种化合物在CEM或HEY细胞显示的IC50值≤20umol/L。活 性范围变化>300倍,SC26和SC27是最有效的(IC50=0.06umol/L), SC 33、SC 34和SC 36的效力最小(IC50=20umol/L)。

太阳城集团根据极性表面积选择化合物

根据Palm等人((1998)J.Med.Chem.41:5382-92,(1997)Pharm. Res.14:568-71,and(1996)J.Pharm.Sci.85:32-9)使用少量化 合物的最初研究和Kelder等人((1999)Pharm.Res.16:1514-9)使 用1,590种经口施用的药物的新近研究,推荐通过被动扩散经口服吸 收的化合物最大极性表面积值为~120埃2。因此,极性表面积>140 埃2的化合物倾向于显示出吸收不良(<10%)而极性表面积<60埃2的 化合物可以被预测显示出完全(>90%)的吸收。极性表面积计算的若干 变量例如动力学,拓扑,和快极性表面积被引入各种软件包(Clark和 Grootenhuis(2003)Curr.Top.Med.Chem.3:1193-203)。如先前 所述我们使用快极性表面积曲线预测吸收(Egan等人(2000)J.Med. Chem.43:3867-77以及Egan和Lauri(2002)Adv.Drug Deliv.Rev. 54:273-89)并在图15中列出数据。期望落在由95%置信椭圆显示的区 域中的化合物具有有利的吸收和口服生物利用度。所有化合物显示的 快极性表面积<140埃2和log P值<5。因此,使用99%置信椭圆(外 椭圆)或95%置信椭圆(内椭圆;图1)没有观察到明显的违例。

SC21和SC23对一组激素依赖性和非依赖性细胞株显示出显著的效力

虽然我们最初的950种化合物中的许多化合物显示出有利的计算 的物理化学性质,但是在表5中列出的18种化合物在我们最初的筛选 中是最有效的。根据随后对药物耐受细胞株的测试,我们选择SC21 和SC23做进一步评估。一组7种人癌细胞株对SC21和SC23的敏感性 通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑_试验进行评 价。两种药物在不同肿瘤来源的癌细胞株中呈现出高的效力(表6) 而且呈现出太阳城集团和剂量依赖性生长抑制效果(图16)。因此,随SC21 和SC23浓度和暴露太阳城集团的增加体外细胞死亡增加。

表6.乳癌、卵巢癌和前列腺癌细胞株对SC21,SC23和CPT的敏 感性

细胞株 来源 激素受体     p53 pRb   p16 p21                      IC50值(平均±SD)* SC21(nmol/L)  SC23(nmol/L)   CPT(nmol/L) PC3 DU145 NCuP HEY MCF-7 MDA-MB-435 MDA-MB-468 前列腺癌 前列腺癌 前列腺癌 卵巢癌 乳癌 乳癌 乳癌     AR-     AR-     AR+     AR+     ER+     ER-     ER-     null     Mut     WT     WT     WT     Mut     Mut WT null WT ND WT WT null   WT   Mut   WT   WT   WT   WT   ND WT Mut WT ND WT WT WT 3,250±106 120±50 200±70 400±60 40±7 35±7 200±2 2,000±500 50±19 850±200 2,350±212 280±35 240±28 50±14   900±210   25±7   25±6   35±7   30±3   27±2   100±2

缩写:AR:雄激素受体;ER:雌激素受体;WT:野生型;Mut:突 变体;ND:未测定

太阳城集团*细胞毒性浓度(IC50)定义为引起细胞群体减少50%的药物浓度。

太阳城集团这两种药物的活性在前列腺癌细胞株中显著除了PC3细胞,其似 乎是对SC21和SC23敏感性最低的细胞株(IC50值分别为3.2±0.2和 2.0±0.5umol/L)。对这些药物敏感性的差异与雄激素受体(PC3和 DU145突变),p53(PC3 null,DU145和LNCaP野生型的突变体),p21 (DU145突变),或p16(DU145突变;表6)的状态无关。令人感兴趣的 是,SC23在pRb突变细胞株(DU145和MDAMB468)呈现出高的效力。

SC21和SC23还在三种乳癌细胞株中显示出显著的效力而与雌激 素受体(MCF-7和MDA-MB-435为ER+)和p53状态(MDA-MB-435和 MDA-MB-468突变)无关。SC21在卵巢肿瘤衍生的细胞株HEY的活性也 是显著的因为该细胞株似乎特别耐受在卵巢癌中最为通常使用的药物 顺铂.(Buick等人(1985)Cancer Res.45:3668-76和Hamaguchi等 人(1993)Cancer Res.53:5225-32)。但是该细胞株对SC23的敏感 性最小。

SC21处理诱发G1和S期细胞周期阻滞

太阳城集团在DU145和PC3前列腺癌细胞和高转移性MDA-MB-435乳癌细胞和 顺铂耐受HEY卵巢癌细胞中研究了SC21诱发的细胞周期干扰。通过流 式细胞术对DNA谱分析表明SC21在DU145诱发细胞周期G0/G1期阻滞 (图17)。在暴露于SC21 72小时后,65%的细胞仍被保留在G0/G1期, 而对照为46%。观察到的G0/G1的增加伴随着S和G2-M期细胞数量的 减少。在异步乳癌细胞MDA-MB-435中观察到相似的效果(图17)。

值得注意的是SC21在PC3和HEY细胞株中诱发S期阻滞(图17)。 SC21治疗72小时分别在PC3和HEY细胞中导致52%和69%的S期堆积。 在这两种细胞株中观察到的效果与CPT诱发的阻滞相当。

在SC21处理48小时后在MDA-MB-435和PC3细胞中观察到最大阻 滞,持续直至72小时。SC21的这种诱发细胞周期阻滞的特性使得其 是与作用于细胞周期不同阶段的其他药物例如紫杉烷进行组合治疗的 理想药物。

SC21处理诱发凋亡

通过流式细胞术测定SC21和CPT诱发的凋亡(图18)。SC21以 IC80剂量处理72小时诱发12%至15%凋亡,通过计算sub-G0/G1群进行 测定。在相似的条件下CPT导致30%凋亡(图18)。在凋亡细胞死亡 中的早期事件是脂磷酰丝氨酸残基易位至细胞膜外部。这个事件先于 核分裂、DNA断裂、与凋亡最相关的分子出现之前,可容易地通过膜 联蛋白V结合试验进行测定。通过该方法,我们将SC21与CPT进行了 比较。如图19所示,在暴露于SC21和CPT 72小时后,早期加上晚 期凋亡细胞分别达到72%和59%。

SC21在小鼠异种移植模型中显示出体内有效性

在接种人前列腺癌PC3细胞的裸小鼠中对SC21的体内有效性进行 了评估。图10A显示了实验程序的简图。每天以i.p.注射盐水(对照) 和0.3或3mg/kg SC21对动物进行治疗。在给药5天后,中断药物治 疗,每周对动物进行监测两次,持续5周。图20B显示了SC21治疗的 PC3异种抑制模型的经时体积(平均±SD)。SC21显著减少前列腺癌 异种抑制的肿瘤负荷(图20C)而没有明显的毒性。使用SC21的治疗 能够被很好耐受并且不会导致任何药物相关的死亡和体重的变化。在 试验前未治疗对照小鼠平均重量为33.2±1.45g,治疗后为34.3±2.79 g。使用0.3mg/kg SC21治疗的小鼠平均重量为32.1±1.92g,用3.0 mg/kg SC21治疗的小鼠平均重量为33.3±1.89g.。

讨论:

使用药效基团模型以区别抗病毒化合物与抗癌化合物,我们已经 成功的鉴别了新的一类在体内和体外具有显著活性特征的先导化合 物。对这种新类别化合物中的两个成员SC21和SC23相对于一系列人 肿瘤衍生的癌细胞进行了进一步评估。两种化合物均以太阳城集团和剂量依 赖的方式抑制细胞生长。SC21和SC23在前列腺癌细胞中的有效性与 CPT的有效性相当并且其细胞毒效应与雄激素受体、p53、p21和p16 的状态无关。令人感兴趣地是,pRb表达缺失似乎赋予了SC23在DU145 和MDA-MB-468细胞株中更高的敏感性。与PC3前列腺癌细胞相比,SC21 在ER+和ER-乳癌细胞中效力高16至90倍,提示这种化合物可能是治 疗激素受体阳性和阴性乳癌的潜在候选药物。

与SC21对细胞生长的抑制效果一致,我们的数据还显示了这种化 合物阻滞细胞周期进程的能力。SC21的这种特性打开了研究与其他作 用于细胞周期不同阶段的其他药物,例如紫杉烷的创新组合的可能性。 值得注意地,在本研究中使用的不同细胞株在SC21处理后显示不同的 细胞周期干扰。SC21将DU145和MDA-MB-435细胞阻滞在G0/G1期,将 PC3和HEY细胞阻滞在S期。先前,所报道使用不同药物的相似观察 被归因于不同的细胞周期检查点状态和对凋亡的敏感性。(Zuco等人 (2003)Biochem.Pharmacol.65:1281-94,Schiff和Horwitz(1980) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:1561-5,和Lanzi等人(2001) Prostate 48:254-64.)。已经充分确定p53对细胞周期保留在G0/G1期发挥主要作用。我们可以得出结论在这些细胞株中由SC21诱发的细 胞周期阻滞与p53状态无关(DU145中突变,PC3 null)。需要使用不 同p53突变和p53 null的细胞株做进一步研究以更好地理解p53在对 SC21处理的响应中的作用。

太阳城集团已知控制它们的凋亡信号途径和细胞事件对癌症发展和对化疗的 反应具有复杂的影响(Sun等人(2004)J.Natl.Cancer Inst. 96:662-72,Assuncao Guimaraes和Linden(2004)Eur.J.Biochem. 271:1638-50,Pommier等人(2004)Oncogene 23:2934-49,以及 Norbury和Zhivotovsky(2004)Oncogene 23:2797-808)。根据膜联 蛋白V/碘化丙啶染色和sub-G0/G1片断,显然SC21活性以与CPT相当 的方式通过凋亡介导。SC21在体内还显示出针对PC3肿瘤异种移植的 抗肿瘤有效性。对于所有测试剂量发现肿瘤生长显著减少。此外,SC21 能够被很好耐受并且不会导致药物相关的死亡。最后,尽管体外模型 中PC3细胞对SC21的敏感性最低,但SC21在体内呈现针对PC3前列 腺癌异种移植的有效性的事实清楚地显示了其作为新抗癌药的潜力。

总之,考虑到其在各种体外系统,包括本身或获得性对已知药物耐 受的不同细胞株的细胞毒性特性以及它们有利的体内特性,水杨酰肼 似乎代表了通过新的作用机制发挥功能的一类新的抗癌药。这些药物 具有有希望的治疗潜力。

实施例III

表7.一系列SCs在HEY卵巢癌细胞中50%细胞毒性浓度(IC50)值

实施例IV

随后证实了SC23对一组耐受已知药物的细胞的效力促使我们研 究其作用机制。作为新的化学实体,根据化学结构和生物学活性由于 其效力、选择性和新颖性,SC23非常有开发前景。

机制(mechanistic)研究

太阳城集团我们的初步研究显示SC23将细胞阻滞在G0/G1并诱发凋亡。为了 获得对于SC23诱发的细胞毒性所涉及的分子机制的更进一步的了解, 接下来我们使用StaRT-PCR评估了在细胞周期调节、凋亡和肿瘤进程 中涉及的一组基因的表达(表8和图22)。

太阳城集团表8.SC23诱发的在细胞周期,凋亡和增殖中选择的重要基因的 表达

太阳城集团 基因   对照   3小时   6小时   12小时   24小时   48小时 BCL2     182.72     152.37     121.2     122.24     35.99     22.29 BCL2L1     20925.99     9449.42     10428.62     23160.22     30504.02     21299.99 JUN     2499.15     1846.15     4168.04     5419.7     8677.27     9510.55 JUNB     NRa     NR     NR     NR     NR     NR MAD     448.91     496.75     783.05     7122.48     13204.24     12999.27 MAX     NR     NR     NR     NR     NR     NR TNFRSF1A     26.59     15.56     20.58     107.17     26.61     21.29 TP53     1950.14     567.53     1005.63     1663.37     4238.06     2821 NFKB1     4859.08     2694.24     3274.07     6131.17     16919.99     26524.38 TNFSF10     3328.29     82.86     532.07     288.01     151.09     79.65

CASP1     496.95     68.36     80.87     113.28     142.49     184.55 PCNA     11012.48     8574.58     6433.1     5756.09     12795.59     6913.72 TNFAlP1     3865.15     4737.75     7127.73     22572.81     39858.96     49955.6 DAP     18155.74     9037.57     12572.87     38087.74     56353.65     70325.95 KDR     NR     NR     NR     NR     NR     NR MAP3K14     25.78     55.57     68.69     158.89     143.47     720.55 CCNA2     160.4     126.84     348.88     211.27     241.1     137.61 CDC2     1863     2365.6     1650.84     1566.64     2054.95     497.44 CDK7     2690.33     1068.26     778.75     2551.62     9983.36     19212.16 CDK8     668.56     412.64     354.76     605.61     1706.26     3052.4 CDKN1A     15.07     11.42     27.06     129.69     225.4     288.58 CDKN1B     112.64     72.37     390.76     310.81     2092.37     414.6 CDKN2A     8786.98     415.63     5611.87     403.27     163.48     3382.09 CDKN2C     439     458.41     781.31     770.42     904.8     650.26 E2F1     NR     NR     NR     NR     NR     NR E2F4     7513.16     7540.97     1285.78     1673.69     1582.79     3738.46 E2F5     618.18     268.09     243.27     486.8     1178.84     2144.23 MYC     3311.86     974.69     2650.11     5205.65     11117.04     8944.84 RB1     9989.91     7076.29     5973.3     3301.83     5935.72     6552.57 RBL2     6254.58     1287.91     2112.09     2698.44     8604.92     11571.33 CCND3     245.98     195.17     175.1     137.33     404.3     641.75 CCNG1     31936.56     2956.79     6161.69     9794.14     17499.15     25388.52 CCNE1     106.85     51.36     33.08     48.10     47.28     146.61 CDC25C     519.06     394.83     606.06     779.22     326.46     68.37 TGFBR2     3697.83     1420.02     2582.67     6799.19     15367.23     5072 TGlF     22071.87     3112.84     8002.87     13858.11     15445.36     19849.69 TRAF4     93.2     69.06     91.86     222.84     242.44     298.28 CYP1A2     17.14     59.45     10     69     36.62     37.48 PTGS2     69.22     82.69     157.43     2138.52     19413.37     26516.88

按规定太阳城集团使用SC23处理T24膀胱癌细胞,通过StaRT-PCR分析 样品。aNR,无结果。

StaRT-PCRTM(标准逆转录聚合酶链式反应)。Willey等人首先对 其进行了描述((2004)Methods Mol.Biol.258:13-41),在产生有效和 可重复的用于多基因的数值基因表达数据中该技术使用标准化的竞争 性模板(CT)混合物作为内标。在mRNA被转化为cDNA后,将cDNA 与专有的Internal StandardsTM(SMISTM,GeneExpress,Inc.)标准化 混合物混合。在标准混合物中,有对于每种基因存在用于测量的内标 CT以及一种用于参照基因的内标(即β-肌动蛋白,GAPDH)。然后在毛 细管电泳将StaRT-PCRTM产生的扩增子分离。内标CT或NT扩增子的数 量通过测量各个峰面积进行测定。然后将全部数据记录为有利的每106个参照基因(normalizer gene)分子基因的mRNA的分子数。连续稀 释SMISTM允许在<10至107个分子/106个分子参照基因的细胞中观察的 基因表达的7log范围内进行定量测量。在表8中列出的数据是相对 于106个β-肌动蛋白分子被标准化的拷贝数。

在细胞周期调节和细胞增殖中涉及的基因调节。因为SC23诱发 G0/G1阻滞,最初我们感兴趣的是细胞周期基因。因此,我们使用StaRT PCR研究了在SC23诱发的细胞周期调节中涉及的关键基因的表达变 化。已经充分确定在对遗传毒性损伤的反应中,向上调节p53导致将 细胞阻滞在G0/G1,激活DNA修复或当损伤不能修复时驱使细胞凋亡。 p21和p27活化介导p53阻滞(图21)。p21和p27是细胞周期蛋白 依赖激酶抑制剂(CDKi)的Cipl/Kipl家族的成员。和另一种CDKi′s 家族,INK4(p16、p15、p18和p19)一起,它们抑制细胞周期蛋白/ 细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)复合物的活性。这种抑制引起成视网膜母 细胞瘤蛋白(Rb)的hypophosporylation,防止转录因子E2F的释放和 抑制细胞增殖相联系基因的转录。

太阳城集团SC23诱发的G1阻滞与p21和p27的向上调节相关。使用SC23处 理诱发的细胞周期蛋白A和cdk1表达的向下调节,与p53的过度表达 一致。这些数据与SC23处理的细胞中G1停滞相关。正如所料p16的 表达未被检出,这是由于启动子超甲基化,T24细胞是p16缺乏细胞。 虽然在p18表达中没有观察到差异,但是SC23诱发S期早期涉及的两 种激酶cdk7和cdk8的表达的向上调节。

细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白D3和细胞周期蛋白Gl的表达稍 微增加。这些细胞周期蛋白的某些的过度表达与MYC表达的增加一致 (图22)。在SC23处理的细胞中向下调节Cdc25。但是PCNA保持不 变。

转录因子E2F1、E2F4和E2F5被认为是p16INK-pRB途径的下游介 质。我们的数据揭示了当暴露于SC23时Rb样蛋白2(也被称为p130) 以及E2F5转录因子的向上调节(图22)。SC23诱发E2F5的表达但是 减少E2F4的表达。这些数据提示E2F4抑制可能与T24细胞中SC23 诱发的复杂的G1期阻滞有关。这些E2F因子表达的调节反映了p107- 和p103-结合的受体复合物在介导SC23处理的T24细胞中观察到的细 胞周期阻滞中的重要性。这些数据还提示E2F4由pRB家族蛋白的解离 在SC23诱发的细胞毒性(图23)中发挥作用。需要进一步的研究以 证实这种假说。

观察到的NFKB表达的向上调节与其它基因例如增殖基因(细胞周 期蛋白D3和c-MYC)、免疫基因(例如COX2)或抗凋亡基因(Bcl-XL) 过度表达相关。

在凋亡中涉及的基因调节。在本研究中,我们还评估了已知调节 凋亡的关键基因的表达模式。SC23诱发膜联蛋白V基因的表达,数据 与流式细胞术分析相关。SC23诱发这种前凋亡基因的向下调节。但是 与相应地未处理的对照细胞相比,SC23处理的细胞的Bcl2Ll(包括 Bcl-XL和Bcl-Xs成员)的表达基本上不会改变(图21和22,表8)。

SC23还表明通过向上调节MAD、TNF-α(TNFAIP1)、JUN、MAP3K14、 NFKB、膜联蛋白V和DAP基因影响凋亡途径。SC23还诱发半胱天冬酶 1和TNF受体的显著向下调节,Bcl2的向下调节意味着由SC23介导的 凋亡与氧化应激有关,其中线粒体发挥中心作用(图21和22,表8)。

作用模式。为了研究SC23可能的作用模式,我们使用57,000- 探针U113+2表达陈列(Affymetrix)应用基因表达谱比较了进行药物 处理和没有进行药物处理的表达。表达值被截止到10以下,并进行 log转换。最初的过滤除去10%以上样品中表达值小于50的所有基因: 在该阈值以下,“噪音”基本在估计值中并且许多显示这样的低值的 基因可能根本没有表达。对于给定的基因,由于10%为非常低的表达 者,可以仅在单一组(例如对照组)中包括那些未表达的基因。通过 观察两次试验之间高度相关性证实了数据的可重复性(图24)。还研 究了5种已知作用机制的药物将其作为阳性对照。

在如下所述的众多方法中使用Genetrix软件包对这些数据进行 分析以为SC23最可能的作用方式提供线索。

散布图。在最简单的水平,我们研究了SC23表达与每种阳性对照 之间的相关性(图25),全体(图25A)和限于在暴露于任何一种药 物后(图25B)至少改变5倍的基因。与米托蒽醌(r=0.84)、CPT (r=0.80)、依托泊苷(r=0.72)和5FU(r=0.93)相比,关系最近的是 紫杉醇(相关性,r=0.96)。

太阳城集团研究表达中具有标记的变化的基因。我们接下来研究了SC23处理 后向上调节至少5倍的基因(图9)。特别令人感兴趣的首先是三种 基因,微管相关蛋白4,微管亲合力调节激酶2和4,暗示其机制与紫 杉醇相似。应该注意的是紫杉醇,虽然是熟知的微管毒素但还没有显 示出调节激酶2和4。

表9.在对SC23治疗的反应中所选择的显著向上调节的基因列表

代码   基因   代码   基因 4134 2011 57787 10766 7423 7422   51281   53916   7991 5089   6988 3976 26145 3669 3460 64108 11128   微管相关蛋白4   微管亲合力调节激酶2   微管亲合力调节激酶4   ERBB2车导子   血管内皮生长因子B   血管内皮生长因子     锚蛋白重复序列和MYND域1     RAB4B,RAS致癌基因家族成员     假定前列腺癌肿瘤抑制基因   前B细胞白血病转录因子2     T-细胞白血病易位改变基因   白血病抑制因子   干扰素调节因子2结合蛋白   干扰素刺激基因20kDa   干扰素γ受体2   28kD干扰素应答蛋白   聚合酶(RNA)III   83855   80830   7517   5595   55361   6300     5563     55066     23646   3710     5914   84957   2026   8614   8862   23654   1522   kruppel样因子16   载脂蛋白L,6   X射线修复互补缺陷修复   细胞分裂素活化蛋白激酶3   磷脂酰肌醇4-激酶II型   细胞分裂素活化蛋白激酶   12   蛋白激酶,AMP-活化,α2   催化亚型   丙酮酸脱氢酶磷酸酶调节   亚型   磷脂酶D3   肌醇1,4,5-三磷酸酯受体,   3型   维甲酸受体α   肿瘤坏死因子受体超家族   烯醇化酶2(γ,神经元)   stanniocalcin 2   apelin   plexin B2   组织蛋白酶Z

  85441     10111   83463   过氧化物酶增值子活性受体A   相互作用复合物285   RAD50同系物(S.cerevisiae)   MAX二聚蛋白3     8347       8357   组蛋白1,H2bc     组蛋白1,H3h

太阳城集团我们还研究了在对SC23、紫杉醇和5FU的反应中向上调节的基因 的重叠。在三种化合物之间有175个共同基因(图26),SC23和紫杉 醇有29个共同基因,SC23和5-FU之间有10个共同基因,紫杉醇和 5-FU之间有31个基因。

归类:被发现使用六种药物中任何一种处理后(N=1147)向上调节 至少5倍的基因被用作主成份和分级聚类分析的基础以研究相对于其 他五种药物将SC23分类到何处。对于所有观察的这些基因的主要成分 分析表明倾向于相对紧密地将重复的分类到一起,两种拓扑异构酶II 抑制剂形成一组,其它已知药物形成第二组,而SC23和紫杉醇分为一 组(图27)。在分级聚类中相似的模式是显而易见的,相对于基因表达 的变化这再一次确定紫杉醇是与SC23最近的相邻药物。

总之,我们的基因表达分析提示SC23的机制与紫杉醇类似,尽管 两种化合物的结构截然不同并且将细胞阻滞在不同的细胞周期阶段。

蛋白组学分析

太阳城集团SC23处理的细胞向上调节分子量范围为8-58kDa的各种蛋白。将SC23处理的和未处理的T24细胞的总的蛋白提取物在SDS-PAGE凝 胶上进行比较揭示了蛋白内容物的复杂性和明显地向上调节分子量范 围为8-58kDa的某些蛋白(图28)。然后使用2DE分离这些蛋白(图29)。 如上文,用SC23进行处理导致许多蛋白的显著向上调节。我们使用对 SC23处理DU145细胞进行相似的分析。

然后使用PDQuest(BioRad)对所有2D凝胶进行定量并鉴别了大 约125个与未处理样品相比变化显著(>2倍)的斑点。图30显示了 凝胶具有代表性的的部分。由图30中显示的斑点鉴别的蛋白是β-微 管蛋白、myc启动子结合蛋白(MPB-1)、视网膜神经胶质瘤结合蛋白7、 波形蛋白、烯醇酶、磷酸丙酮酸水合酶β、线粒体ATP合酶β链。

图31显示了由SC23处理的细胞的2-D凝胶电泳分析分离获得的 四种蛋白的代表性串联MS分析。简要地,将CyproRuby染色斑点从凝 胶上切下并经过凝胶胰蛋白酶的消化。在消化结束时,然后由胰蛋白 酶消化的凝胶斑点提取多肽并通过Thermofinnigan LTQ线性离子阱质 谱仪进行分析,与南加利福尼亚大学的Dr.Austin Yang合作进行。 使用Xcalibur 1.4软件获得Tandem MS/MS波谱。在对从先前全扫 描获得三个最高离子峰进行三次连续MS/MS扫描后进行全MS扫描。 在1分钟内一个离子出现三次之后能够进行动力学排除(dynamic exclusion),将该离子放在排除列表(exclusion list)3分钟。其 他质谱数据产生的参数如下:碰撞能35%,全扫描MS质量范围 400-1800m/z,最小MS信号5x104计数,最小MS/MS信号5x103计 数。以95%溶剂A(2%乙腈,1.0%甲酸)和5%溶剂B(95%乙腈,1.0% 甲酸)将肽装载到Michrom Bioresources肽cap trap,然后用5-90% 溶剂B进行线性梯度洗脱。质谱仪装备有使用未涂敷的10μm-ID SilicaTipTM PicoTipTM纳米喷雾(nanospray)发射器(New Objective, Woburn,MA)的纳米喷雾离子源。质谱仪的喷射电压是1.9kV,加热 的毛细管的温度是180℃。

在LC/MS/MS分析结束时,使用ThermoFinnigan的Bioworks 3.1,β测试站点版本对串联质谱进行分析,利用SEQUESTTM算法测 定获得的波谱和NCBI小鼠蛋白FASTA数据库之间的交叉相关分数。以 下参数用于TurboSEQUEST搜索分析:对于蛋白酶没有对酶进行选择, 因为不是所有的蛋白被消化完全;分子量范围:400-4500;阈值:1000; 单同位素;前体质量:1.4;基团扫描:10;最小离子计数:20;电荷 状态(charge State):自动;肽:1.5;片段离子:0;不同的氨基 酸修改:Cys 57.0520。使用比+1离子为1.5、+2离子为2.0、+3离 子为2.5更高的SEQUEST交叉相关分数对结果进行过滤。图31显示β -微管蛋白多肽(EVDEQMLNVQNK)和myc启动子结合蛋白(MPB-1)肽 (VNQIGSVTESLQACK)的MS/MS波谱。一般而言,我们能够鉴别大多数 序列覆盖度(sequence coverage)在40%以上的蛋白。没有对由于 没有足量样品、低蛋白丰度或缺乏可靠的片段而没有显示良好肽覆盖 度的斑点做进一步研究。

太阳城集团总之,我们能够分离一系列在对SC23治疗的反应中显著改变的蛋 白。在若干种过度表达至少4倍的斑点中有β-微管蛋白,其与如上文 所述由我们微阵列分析所鉴别的三种最高的基因有关。

虽然相当详细地和以优选的实施方案对前文进行了描述,但是这 些不应解释为对公开内容的限制。在本领域技术人员能力范围内的改 进和变化均意欲落在本发明的范围内。

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