太阳城集团

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定量侧向流系统和测定.pdf

关 键 词:
定量 侧向 系统 测定
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摘要
申请专利号:

CN200580025931.6

申请日:

20050602

公开号:

CN101035429A

公开日:

20070912

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A01N1/02 主分类号: A01N1/02
申请人: 瑞莱诊断体系有限公司
发明人: 周思亮,W·J·若特,刘宁
地址: 美国加利福尼亚州
优先权: 60/576,327,60/592,202
专利代理机构: 上海专利商标事务所有限公司 代理人: 陈炜
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法律状态
申请(专利)号:

CN200580025931.6

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明涉及包含测试带的侧向流测定和系统,用于检测和定量样本中的分析物,诸如包含细胞和液体的样本,其中测定与容积不相关,并且样本大小少于约100μl,其中测试带包含例如样本过滤器的第一膜,其与可任选择的诸如液体收集器的第二膜毛细作用接触,第二膜(如果存在)与可任选的第三膜或第四膜毛细作用接触,该第三膜诸如是包含可流动的可检测试剂的共轭物垫,该第四膜是可任选的包含可流动的可检测试剂的层析条,所有这些膜都与诸如缓冲液垫的第五膜、诸如吸收剂垫的第六膜、可任选的也是吸收剂垫的第七膜液体接触,或者该层析条取代共轭物垫包含可流动的可检测试剂,其中测试带被配置成支撑从样本中去除红细胞、以及允许液体从样本过滤器到捕获带的单向或双向流动以保留在其中并在其上得到检测。

权利要求书

太阳城集团1.一种用于侧向流测定的测试带,所述侧向流测定用于检测或定量含液体样本中的至少一种分析物,所述测试带包含:(a)第一膜,其中所述第一膜包括样本过滤器,并且所述样本过滤器包括第一孔径和可任选的第一粘合剂;(b)可任选地,第二膜,其中所述第二膜包括第一液体收集器,并且所述第一液体收集器包括第二孔径,其中所述第二膜,如果存在的话,与所述第一膜成毛细作用接触;(c)可任选地,第三膜,其中所述第三膜包含共轭物垫,并且所述共轭物垫,如果存在的话,直接或间接地与层析条成毛细作用接触,且其中所述共轭物垫包括至少一种可流动的可检测试剂,并且所述至少一种可流动的可检测试剂是第一可流动的可检测试剂;(d)第四膜,其中所述第四膜包括层析条,所述层析条包括第一端和第二端、至少一个捕获带、至少一个可任选地包含对照剂的对照带、以及可任选的至少一个可流动的可检测试剂,其中所述至少一个可流动的可检测试剂是第二可流动的可检测试剂,其中所述至少一个捕获带包含用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂,其中所述层析条允许液体从第一端向第二端、或从第二端向第一端的侧向流动,并且其中所述层析条与所述第一、第二或第三膜的至少之一成直接或间接地毛细作用接触;(e)可任选地,第五膜,包括用于施加样本、缓冲液、或试剂的缓冲液垫,其中所述第五膜,如果存在的话,与所述第四膜成毛细作用接触、并可任选地包含第二粘合剂;(f)第六膜,其中所述第六膜包含第一吸收垫,并且所述第一吸收垫与所述层析带成直接或间接地毛细作用接触;(g)可任选地,第七膜,其中所述第七膜包括第二吸收垫,并且所述第二吸收垫,如果存在的话,与第六膜成毛细作用接触;以及(h)可任选地,第八膜,其中所述第八膜包括第二液体收集器,并且所述第二液体收集器,如果存在的话,与所述第四膜和第五膜,如果存在的话,成毛细作用接触;以及其中所述测试带被配置成允许样本中至少一种分析物的检测或定量,并且所述样本包含红细胞。2.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带包含所述第二膜,并且第二孔径与第一孔径的比小于约20并大于约1。3.如权利要求2所述的测试带,其特征在于,第二孔径与第一孔径的比小于约10。4.如权利要求2所述的测试带,其特征在于,第二孔径与第一孔径的比约为7。5.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带包括所述第二膜,并且其中所述第一膜的至少一部分置于所述第二膜之上。6.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带包括所述第二膜和共轭物垫,并且所述第一膜通过所述第二膜与所述共轭物垫成毛细作用接触、但不与所述共轭物垫物理接触。7.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带包含所述第五膜,并且所述第五膜包含第二粘合剂。8.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述第一吸收垫与所述第五膜成直接或间接地毛细作用接触。9.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带包括所述第五膜,所述第五膜包含所述第二粘合剂,并且其中所述测试带被配置成将样本施加至所述第五膜、并将缓冲液施加至所述第一膜。10.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述第一膜包含所述第一粘合剂,所述测试带包含所述第五膜,并且其中所述测试带被配置成将样本施加至所述第一膜、并将缓冲液施加至所述第五膜。11.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带包含所述第五膜,所述第一和第五膜分别包含所述第一和第二粘合剂,并且其中所述测试带被配置成将样本施加至所述第一和第五膜。12.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成以图6所示的方式工作。13.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成以图7所示的方式工作。14.如权利要求1所述的测试带,其特征在于,所述第六或第七膜置于毗邻所述样本过滤器、并置于与所述缓冲液垫相对的一侧上。15.一种用于侧向流测定的测试带,所述侧向流测定用于检测含液体样本中的至少一种分析物,所述测试带包含:(a)包括样本过滤器的第一膜,其中所述样本过滤器可任选地包含粘合剂;(b)包括层析条的第二膜,其中所述层析条包含第一端和第二端、至少一个包含用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂的捕获带、至少一个对照带、以及可任选的第一可流动的可检测试剂,其中所述层析条支撑液体从第一端向第二端或从第二端向第一端的侧向流动,并且其中所述层析条与所述样本过滤器成毛细作用接触;(c)可任选地,包括共轭物垫的第三膜,其中所述共轭物垫包含第二可流动的可检测试剂,并且所述共轭物垫,如果存在的话,与所述层析条成毛细作用接触;(d)包括缓冲液垫的第四膜,其中所述缓冲液垫与所述共轭物垫或所述层析条成毛细作用接触;(e)包括第一吸收垫的第五膜;(f)可任选地,包括第二吸收垫的第六膜;以及(g)可任选地,包括第一液体收集器的第七膜;其中所述测试带被配置成允许对样本中至少一种分析物的检测或定量,并且所述样本包含红细胞。16.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述样本过滤器、第一液体收集器、第二液体收集器、共轭物垫或第五膜,如果存在的话,包含玻璃纤维材料。17.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述第一膜完全位于所述第二膜上。18.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述测试带包含共轭物垫,并且其中所述共轭物垫接收来自所述样本过滤器的液体、并与所述层析条重叠一足以使液体从所述共轭物垫流向所述层析条的距离。19.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述测试带包括第一液体收集器,并且所述第一液体收集器与所述层析条重叠一足以使液体从所述样本过滤器流向所述层析条的距离。20.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述样本过滤器包含所述第一粘合剂。21.如权利要求20所述的测试带,其特征在于,所述第一粘合剂从由凝集素和抗-血细胞抗体组成的组中选择。22.如权利要求21所述的测试带,其特征在于,所述抗-血细胞抗体是抗-带3抗体或抗血型糖蛋白抗体。23.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述样本过滤器能在样本中使液体与细胞分离。24.如权利要求23所述的测试带,其特征在于,所述细胞是红细胞。25.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述捕获试剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗原。26.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述层析条包含至少两个对照带。27.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述层析条包含硝基纤维素膜。28.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述层析条包含熔合在一起的聚合体的微粒。29.如权利要求28所述的测试带,其特征在于,所述聚合体是聚乙烯。30.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述第一或第二可流动的可检测试剂包含从由以下物质组成的组中选择的试剂:金、有色试剂、荧光试剂、化学发光试剂、生物发光试剂,以及可与另一种试剂组合以产生颜色、荧光、化学发光或生物发光的试剂。31.如权利要求30所述的测试带,其特征在于,所述可流动的可检测试剂包含胶体金。32.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述第一或第二可流动的可检测试剂包含抗体或抗原。33.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述测试带以如图2、3、3、4、5、8或9中之一所示的方式配置。34.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述测试带包含所述第三膜。35.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述测试带没有所述共轭物垫,并且所述层析条包含第二可流动的可检测试剂。36.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成支撑单向或双向液体流动。37.如权利要求36所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成支撑单向流动。38.如权利要求37所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成使单向流动是停流。39.如权利要求37所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成使单向流动是逆流。40.如权利要求36所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成支撑双向流动。41.如权利要求1或15所述的测试带还包含支撑测试带的衬垫。42.如权利要求41所述的测试带,其特征在于,所述衬垫包含液体不可渗透的衬垫。43.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述层析膜是高容量蛋白结合膜。44.如权利要求15所述的测试带,其特征在于,所述缓冲液垫悬突于共轭物垫之上。45.如权利要求15所述的测试带,其特征在于,所述测试带被配置成如图2所示。46.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述样本包含两种分析物,并且所述层析条包含两个分离的捕获带,每个捕获带都包含固定的捕获试剂,所述固定的捕获试剂专用于捕获一种分析物但不是另一种。47.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述样本包含三种分析物,并且所述层析条包含三个分离的捕获带,每个捕获带都包含固定的捕获试剂,所述固定的捕获试剂专用于捕获一种分析物但不是另两种。48.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述分析物是从以下物质组成的组中选择的分析物:抗原、抗体、激素、药物、细胞蛋白、DNA、心脏标记物、肿瘤标记物、配体、受体和自身免疫疾病标记物。49.如权利要求48所述的测试带,其特征在于,所述分析物是抗原,并且所述抗原是与感染性试剂相关联的抗原。50.如权利要求49所述的测试带,其特征在于,所述感染性试剂是从病毒、细菌、真菌、或蛋白感染素组成的组中选择的。51.如权利要求50所述的测试带,其特征在于,所述感染性试剂是病毒,并且其中所述病毒是从包含HIV、甲型、乙型、丙型、丁型肝炎病毒、单纯疮疹病毒、细胞巨化病毒(CMV)、绒毛状瘤病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、鼻病毒、和牛痘病毒的组中选择的。52.如权利要求50所述的测试带,其特征在于,所述感染性试剂是细菌,并且所述细菌是从由革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌中选择的。53.如权利要求52所述的测试带,其特征在于,所述细菌是从由炭疽芽孢杆菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、鼠疫杆菌、沙门氏菌类和志贺氏菌属类组成的组中选择的。54.如权利要求48所述的测试带,其特征在于,所述分析物是从包含hCG、甲状腺素、TSH的组中选择的激素。55.如权利要求48所述的测试带,其特征在于,所述分析物选自包含肿瘤标记物、心脏标记物、和自身免疫疾病标记物的组。56.如权利要求55所述的测试带,其特征在于,所述分析物是肿瘤标记物,并且所述肿瘤标记物是从包含前列腺特异性抗原、癌胚抗原和α-胎蛋白的组中选择的。57.如权利要求48所述的测试带,其特征在于,所述分析物是细胞蛋白。58.如权利要求48所述的测试带,其特征在于,所述分析物是心脏标记物,并且所述心脏标记物是从包含以下物质的组中选择的:肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌酸激酶MB同功酶(CK-MB)、肌红蛋白、C反应蛋白(CRP)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶同功酶BB(GPBB)、B型利钠肽(BNP)和Pro-BNP。59.如权利要求1或15所述的测试带,其特征在于,所述样本过滤器在结合粘合试剂之前用清洁剂预处理。60.一种用于侧向流测定的测试带,所述侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物,所述测试带包含:(a)具有第一端和第二端的层析条,所述测试带包括用于捕获分析物的捕获带;(b)与所述层析条的第一端可操作接触的液体传递元件,所述液体传递元件从包含样本垫和第一样本过滤器的组中选择,所述液体传递元件被放置成使施加到所述液体传递元件的液体流过所述液体传递元件并被施加到所述层析条;(c)至少一个与所述液体传递元件可操作接触的吸收垫;(d)可任选地,与所述层析条的第二端可操作接触的共轭物垫,所述共轭物垫包含所述分析物的带标记的特异性结合配偶体;(e)与所述共轭物垫,如果存在的话、或者与所述层析条的第二端,如果不存在所述共轭物垫的话,有效接触的液体收集器,以使施加到所述液体收集器的液体流过所述液体收集器并流至所述共轭物垫,如果存在的话、或流至所述层析条的第二端,如果共轭物垫不存在的话;(f)与所述液体收集器可操作接触的第二样本过滤器,以使流经第二样本过滤器的液体被施加到所述液体收集器;以及(g)可任选地,与所述层析条的一侧相接触的衬垫,所述衬垫被设置成使液体能无障碍地从与所述层析条第一端可操作接触的液体传递元件、和从与所述层析条第二端可操作接触的液体收集器或共轭物垫流入所述层析条。61.如权利要求60所述的测试带,其特征在于,所述液体传递元件是第一样本过滤器。62.一种用于侧向流测定的测试带,所述侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物,所述测试带包含:(a)具有第一端和第二端的层析条,所述测试带包含用于捕获分析物的捕获带;(b)与所述层析条的第一端有效接触的第一样本过滤器,所述第一样本过滤器被放置成使施加到所述第一样本过滤器的液体流经所述第一样本过滤器并被施加到所述层析条;(c)至少一个与所述第一样本过滤器的至少一部分可操作接触的吸收垫,从而所述至少一个吸收垫能在层析条的第一端从所述层析条中抽出液体,所述液体经由所述样本过滤器被抽回;(d)可任选地,与层析条的第二端可操作接触的共轭物垫,所述共轭物垫包含所述分析物的可流动的带标记特异性结合配偶体;(e)与所述共轭物垫,如果存在的话、或者与所述层析条的第二端,如果不存在所述共轭物垫的话,可操作接触的液体收集器,以使施加到所述液体收集器的液体流过液体收集器并流至所述共轭物垫,如果存在的话、或流至所述层析条的第二端,如果共轭物垫不存在的话;(f)与所述液体收集器可操作接触的第二样本过滤器,以使流经所述第二样本过滤器的液体被施加到所述液体收集器;以及(g)可任选地,与所述层析条的一侧相接触的衬垫,所述衬垫被设置成使液体能无障碍地从与所述层析条第一端可操作接触的第一样本过滤器、和从与层析条第二端可操作接触的液体收集器或共轭物垫流入层析条。63.如权利要求62所述的测试带,其特征在于,所述分析物的可移动的带标记的特异性结合配偶体位于所述层析条内并毗邻所述层析条的第二端,从而它可被流经所述液体收集器的液体移动。64.一种用于侧向流测定的测试带,所述侧向流测定用于检测样本中的至少一种分析物,所述测试带包含:(a)包含第一端和第二端的层析条、至少一个包含用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂的捕获带、以及至少一个包含用于确定非特异性结合的固定对照试剂的对照带;(b)共轭物垫,其中所述共轭物垫与所述层析条的第二端成毛细作用接触,以及其中所述共轭物垫包含固定的可检测试剂,所述可检测试剂能结合至少一种分析物或在捕获所述分析物后结合所述捕获试剂;(c)在靠近第二端的一侧上毗邻所述共轭物垫的样本过滤器,其中所述样本过滤器可任选地包含粘合试剂,并且所述样本过滤器与所述层析条成毛细作用接触;(d)可任选地,液体收集器,如果存在的话,位于所述样本过滤器和所述层析条之间;(e)可任选地,置于所述层析条第一端处、并与所述层析条成毛细作用接触的缓冲液垫;(f)置于所述层析条第一端处、并与所述层析条成直接或间接地毛细作用接触的第一吸收垫;以及(g)可任选地,第二吸收垫,如果存在的话,与所述第一吸收剂垫成毛细作用接触;其中所述测试带允许含全细胞的样本中的分析物的检测或定量。65.如权利要求64所述的测试带,其特征在于,所述第一吸收垫与所述层析条成直接毛细作用接触。66.如权利要求64所述的测试带,其特征在于,所述第一吸收垫与所述层析条成间接毛细作用接触。67.包含如权利要求1、15、60、62或64所述的测试带的测试盒,其特征在于,所述测试盒适于在设备中被读取。68.如权利要求67所述的测试盒,其特征在于,所述测试盒包含用于施加样本或缓冲液的窗口-1和窗口-2。69.如权利要求68所述的测试盒,其特征在于,窗口-2允许将样本施加至所述测试盒的测试带的样本过滤器。70.如权利要求68所述的测试盒,其特征在于,窗口-1允许将样本施加至所述测试盒的测试带的缓冲液垫。71.如权利要求68所述的测试盒,其特征在于,窗口-1允许将缓冲液施加至所述测试盒的测试带的缓冲液垫。72.一种用于实施侧向流测定的方法,所述侧向流测定用于检测含液体样本中的分析物,所述方法包含以下步骤:(a)提供如权利要求1所述的测试带;(b)将样本的第一等分试样施加至所述第一膜上;(c)允许来自第一等分试样的液体溶解可检测试剂;(d)允许可检测试剂和来自第一等分试样的液体流至所述层析条上的捕获带;以及(e)允许样本中的分析物,如果有的话,以及可检测试剂在所述捕获带上被捕获。73.如权利要求72所述的方法,其特征在于,所述方法还包含在施加第一样本前预先湿润所述层析条的步骤。74.如权利要求73所述的方法,其特征在于,预先湿润层析条的步骤包含将缓冲液施加到所述第五膜上。75.如权利要求74所述的方法,其特征在于,所述缓冲液从包含磷酸盐缓冲盐、林格氏溶液、Hank氏溶液、和Tris的组中选择。76.一种用于实施侧向流测定的方法,所述侧向流测定用于检测含液体样本中的分析物,所述方法包含以下步骤:(a)提供如权利要求15所述的测试带;(b)将样本的第一等分试样施加至所述第五膜上,其中所述第五膜毗邻所述吸收垫;(c)将样本的第二等分试样施加至所述第一膜上;(d)允许来自第二等分试样的液体溶解可检测试剂;(d)允许可检测试剂和来自第二等分试样的液体流至所述层析条上的捕获带;(e)允许来自第二等分试样的液体流至所述层析条上的捕获带;(f)允许样本中的分析物,如果有的话,以及可检测试剂在所述捕获带上被捕获。77.一种用于实施侧向流测定的方法,所述侧向流测定用于检测含液体样本中的分析物,所述方法包含以下步骤:(a)提供如权利要求60所述的测试带;(b)将样本施加至所述第一膜上;(c)允许来自所述第一膜的液体从所述层析条的第一端流向所述层析条的第二端;(d)将缓冲液施加至所述缓冲液垫;(e)允许缓冲液溶解可检测试剂;(f)允许可检测试剂流至所述层析条上的捕获带;以及(e)允许样本中的分析物,如果有的话,以及可检测试剂在所述捕获带上被捕获。78.如权利要求72、76、或77中任一项所述的方法,其特征在于,所述可检测试剂存在于所述共轭物垫中。79.如权利要求72、76、或77中任一项所述的方法,其特征在于,所述可检测试剂存在于所述层析条上。80.如权利要求72、76、或77中任一项所述的方法,还包含对在所述捕获带上捕获的可检测试剂进行定量的步骤。81.如权利要求80所述的方法,其特征在于,定量在所述捕获带上捕获的可检测试剂的步骤是通过反射能力测量执行。

说明书



相关申请的交叉引用

本申请在此要求Zhou等人2004年6月2日提出的题为“Quantitative Lateral Flow System and Assay”的美国临时专利申请No.60/576,327、以及Zhou等人2004 年7月29日提出的同样题为“Quantitative Lateral Flow System and Assay”的美国临 时专利申请No.60/592,202的优先权。这些临时申请的公开内容通过引用全部结合 于此。

技术领域

太阳城集团本申请一般涉及定性和定量测定及系统,该定性和定量测定及系统用于检测 生物样本中,尤其是包含全血、红细胞、白细胞、或其它细胞类型的样本中至少一 种分析物的存在,并测定或定量该至少一种存在的分析物的数量。

背景技术

太阳城集团很多人尝试设计用于检测例如包含全血、红细胞、白细胞的血液样本的生物 样本中分析物的存在和数量的侧向流分析,但失败了。失败的原因很多,但可能主 要归因于以下因素:例如产生高背景噪声的红细胞溶血、例如导致红细胞渗漏到层 析条上的低过滤效率、需要相对较大量的样本(例如需要100μl样本或以上)、溶 解共轭物或可检测试剂的低效、当存在细胞时由于细胞体积变化引起的体积变化、 分析太阳城集团长、以及溶解用于检测分析物的共轭物的低效。需要设计能够克服现有技 术中这些问题的一个或多个侧向流测定和系统。

太阳城集团此外,需要简化用于侧向流测定的测试带的结构以提高测定效率和降低制造 成本。

Polito等人的美国专利No.6,136,610阐述了用于实施侧向流测定的方法和装 置。Thayer等人的美国专利No.6,528,323阐述了用于进行侧向流测定的双向侧向 流测试带和方法。尽管这些专利中阐述的方法和系统对于检测和定量大多数分析物 是有用的,但这些专利未教授这些方法和系统如何能用于分析含有包括红细胞和/ 或白细胞或其它细胞类型的细胞的样本。PCT出版的已公开专利申请No.WO 03/008933阐述了用于对包含全细胞的样本进行侧向流测定的测试带。然而,WO 03/008933中的测试带可被改良以简化结构、提高效率、可靠性、减少体积相关性 并减少制造成本。

不同的策略已被用于从例如血液样本的样本中去除例如红细胞的细胞,以便 于检测分析物,例如传染性疾病生物体或针对传染性疾病生物体的抗体。然而,至 今为止,很少策略能有良好效果。例如,Doshi等人的美国专利No.5,766,552公开 了使用多孔材料,诸如包含游离粘合剂和与成核微粒密切相关的微粒相关粘合剂的 吸收垫。该过滤系统需要大约100μl全血,如图4中所示。

人类红血球在它们的细胞表面上包含几种跨膜蛋白质,这几种跨膜蛋白质可 能是制造针对红细胞的抗体的合适靶点。例如,带3与氯化物和重碳酸盐穿越细胞 膜的电中性交换相关联。带3是911氨基酸的糖蛋白,具有结合细胞骨架、血色素 和糖酵解酶的43kDa氨基末端细胞溶质结构域,以及介导阴离子转运的52kDa 羧基末端细胞膜结构域,如Wang,D.N.(1994)中所阐述的

已提纯带3的两种肽,C1包含Ala893-Val911而KS4包含Gly647-Arg656, 如在Fu,G.等人(2004)中描述的,肽C1被发现具有酶活性,以剂量相关的方式在 Leu118-SeM 19处分解血型糖蛋白A9(GPA),但肽KS4在相同条件下不分解GPA。

太阳城集团人红血球在它们的细胞表面上还包含另一种蛋白,血型糖蛋白。已报道血型 糖蛋白(GPA)增强爪蟾卵细胞表面上带3阴离子转运活性的表达。Young,MT.和 Tanner,M.J.(2003)。作者发现GPA的C末端胞质尾区增强带3向细胞表面的穿行, 而细胞外剩余部分68-70增加带3的特殊阴离子转运活性。

太阳城集团至今为止,还是缺乏能用于在医疗点环境测定诸如血液样本的生物样本中的 分析物的快速、有效和高效定量的侧向流测定和系统,或者能用于测定存在于例如 从针刺手指得到的少量样本中的分析物的侧向流测定和系统,或者与量无关的能用 于测定分析物的、或解决现有技术侧向流测定和系统中其它问题的侧向流测定和系 统。

发明内容

因此,本发明的一个目的是为用于测定生物样本中的分析物的现有技术侧向 流测定和系统所面临的问题提供解决方案,这些生物样本包括但不限于包含诸如红 细胞、或白细胞、或其它细胞类型的细胞的样本。

太阳城集团本发明的另一目的是提供侧向流测定和系统,包含测试带和/或用于容纳定量 测试带的测试盒。

本发明的又一目的是提供如上的与量无关的侧向流测定和系统。

本发明的再一目的是提供如上的能使用少量样本实现的侧向流测定和系统, 该量为例如在小于约100μl的范围内。典型地,取样量少于约90μl。更典型地, 取样量小于约80μl。优选地,取样量小于约70μl。更优选地,取样量小于约60 μl。更进一步优选地,取样量小于约50μl。最优选地,取样量为约40μl。

本发明的另一目的是提供如上的对溶解共轭物或可检测试剂有效的侧向流测 定和系统。

太阳城集团本发明的又一目的是提供如上的提供对诸如红细胞的细胞的良好过滤的侧向 流测定和系统。

太阳城集团根据本发明的目的之一,提供如下发明。

一般而言,本发明的一个实施例包括用于侧向流测定的测试带,侧向流测定 用于检测或定量含液体样本中的至少一种分析物,该测试带包括:

太阳城集团(1)第一膜,其中该第一膜包含样本过滤器,而该样本过滤器包含第一孔径 和(可任选地)第一粘合剂;

(2)(可任选地)第二膜,其中该第二膜包含第一液体收集器,而该第一液体 收集器包含第二孔径,其中第二膜如果存在则与第一膜毛细作用接触。

太阳城集团(3)(可任选地)第三膜,其中该第三膜包含共轭物垫,并且该共轭物垫如果 存在则直接或间接地与层析条毛细作用接触,且其中共轭物垫包含至少一种可流动 的可检测试剂,而该至少一种可流动的可检测试剂是第一可流动的可检测试剂。

(4)第四膜,其中该第四膜包含层析条,所述层析条包含第一端和第二端、 至少一个捕获带、至少一个任选地包含对照试剂的对照带;和(可任选地)至少一 种可流动的可检测试剂,其中该至少一种可流动的可检测试剂是第二可流动的可检 测试剂,其中至少一个捕获带包含用于捕捉至少一种分析物的固定捕获试剂,其中 层析条允许液体从第一端向第二端或从第二端向第一端的侧向流动,并且其中层析 条与第一、第二或第三膜中的至少一个直接或间接地毛细作用接触。

太阳城集团(5)(可任选地)第五膜,包含用于施加样本、缓冲液、或试剂的缓冲液垫, 其中该第五膜如果存在则与第四膜毛细作用接触,并可任选地包含第二粘合剂;

太阳城集团(6)第六膜,其中该第六膜包含第一吸收垫,并且该第一吸收垫与层析带直 接或间接毛细作用接触。

太阳城集团(7)(可任选地)第七膜,其中该第七膜包含第二吸收垫,并且该第二吸收 垫如果存在则与第六膜毛细作用接触;以及

太阳城集团(8)(可任选地)第八膜,其中该第八膜包含第二液体收集器,并且该第二 液体收集器如果存在则与第四膜和第五膜(如果存在)毛细作用接触;以及

太阳城集团其中测试带被配置成允许样本中至少一种分析物的检测或定量,并且样本包 含红细胞。

典型地,测试带包含第二膜,且第二孔径与第一孔径的比小于约20并大于约 1。

太阳城集团在一个可选实施例中,测试带包含第二膜,并且其中至少第一膜的至少一部 分置于第二膜之上。

在另一个可选实施例中,测试带包含第二膜和共轭物垫,并且第一膜通过第 二膜与共轭物垫毛细作用接触,但不与共轭物垫物理接触。

在又一个可选实施例中,测试带包含第五膜,并且第五膜包含第二粘合剂。

太阳城集团在再一个可选实施例中,第一吸收垫与第五膜直接或间接毛细作用接触。

太阳城集团本发明的另一个实施例包含用于侧向流测定的测试带,该侧向流测定用于检 测含液体样本中的至少一种分析物,该测试带包含:

(1)包含样本滤过器的第一膜,其中样本滤过器可任选地包含粘合剂;

太阳城集团(2)包含层析条的第二膜,其中层析条包含第一端和第二端、至少一个包含 用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂的捕获带、至少一个对照带、以及(可任 选地)第一可流动的可检测试剂,其中层析条支撑液体从第一端向第二端或从第二 端向第一端的侧向流动,并且其中层析条与样本过滤器毛细作用接触;

(3)(可任选地)包含共轭物垫的第三膜,其中该共轭物垫包含第二可流动 的可检测试剂,并且共轭物垫如果存在则与层析条毛细作用接触;

(4)包含缓冲液垫的第四膜,其中缓冲液垫与共轭物垫或层析条毛细作用接 触;

(5)包含第一吸收垫的第五膜;

(6)(可任选地)包含第二吸收垫的第六膜;和

太阳城集团(7)(可任选地)包含第一液体收集器的第七膜;

其中测试带被配置成允许样本中至少一种分析物的检测或定量,并且样本包 含红细胞。

本发明的再一个实施例包含用于侧向流测定的测试带,该侧向流测定用于检 测样本中的至少一种分析物,测试带包含:

(1)具有第一端和第二端的层析条,该测试带包含用于捕获分析物的捕获带;

(2)与层析条的第一端有效接触的液体传递元件,该液体传递元件从包含样 本垫和第一样本过滤器的组中选择,该液体传递元件被放置为使施加到液体传递元 件的液体经过液体传递元件传递并被施加到层析条;

(3)至少一个与液体传递元件有效接触的吸收垫;

太阳城集团(4)(可任选地)与层析条的第二端有效接触的共轭物垫,该共轭物垫包含 分析物的带标记的特异性结合配偶体;

(5)液体收集器,与共轭物垫(如果存在)或(如果不存在共轭物垫)与层 析条的第二端有效接触,以使施加到液体收集器的液体经过液体收集器传递至共轭 物垫(如果存在),或传递至层析条的第二端(如果共轭物垫不存在);

太阳城集团(6)第二样本过滤器,与液体收集器有效接触,以使经过第二样本过滤器传 递的液体被施加到液体收集器;和

太阳城集团(7)(可任选地)与层析条的一侧相接触的衬垫,衬垫被设置成使液体能够 无障碍地从与层析条第一端有效接触的液体传递元件和从与层析条第二端有效接 触的液体收集器或共轭物垫进入层析条。

本发明的又一个实施例包含用于侧向流测定的测试带,该侧向流测定用于检 测样本中的至少一种分析物,该测试带包含:

(1)具有第一端和第二端的层析条,测试带包含用于捕获分析物的捕获带;

太阳城集团(2)与层析条的第一端有效接触的第一样本过滤器,该第一样本过滤器放置 成使施加到第一样本过滤器的液体经过第一样本过滤器传递并被施加到层析条;

太阳城集团(3)至少一个与至少一部分第一样本过滤器有效接触的吸收垫,从而该至少 一个吸收垫能在层析条第一端从层析条抽出液体,该液体经过样本过滤器被吸回;

太阳城集团(4)(可任选地)与层析条的第二端有效接触的共轭物垫,该共轭物垫包含 分析物的可流动的带标记特异性结合配偶体;

(5)液体收集器,它与共轭物垫(如果存在),或者与层析条的第二端(如 果不存在共轭物垫)有效接触,以使施加到液体收集器的液体经过液体收集器传递 至共轭物垫(如果存在),或传递至层析条的第二端(如果共轭物垫不存在);

(6)第二样本过滤器,与液体收集器有效接触,以使经过第二样本过滤器传 递的液体被施加到液体收集器;和

太阳城集团(7)(可任选地)与层析条的一侧相接触的衬垫,衬垫被设置成使液体能够 无障碍地从与层析条第一端有效接触的第一样本过滤器、和从与层析条第二端有效 接触的液体收集器或共轭物垫进入层析条。

太阳城集团本发明的又一个实施例包含用于侧流动测定的测试带,该侧向流测定用于检 测样本中的至少一种分析物,该测试带包含:

(1)包含第一端和第二端的层析条、包含用于捕获至少一种分析物的固定捕 获试剂的至少一个捕获带、以及包含用于检测非特异性结合的固定对照试剂的至少 一个对照带;

(2)共轭物垫,其中共轭物垫与层析条的第二端毛细作用接触,且其中共轭 物垫包含固定的可检测试剂,该可检测试剂能够结合至少一种分析物或在捕获分析 物后结合捕获试剂;

(3)在靠近第二端的一侧上毗邻共轭物垫的样本过滤器,其中样本过滤器可 任选地包含粘合剂,并且样本过滤器与层析条毛细作用接触;

太阳城集团(4)(可任选地)液体收集器(如果存在)置于样本过滤器和层析条之间;

太阳城集团(5)(可任选地)置于层析条第一端处并与层析条毛细作用接触的缓冲液垫;

(6)置于层析条第一端处并与层析条直接或间接毛细作用接触的第一吸收 垫;和

(7)(可任选地)第二吸收垫(如果存在)与第一吸收垫毛细作用接触;其 中测试带允许检测或定量包含全细胞的样本中的分析物。

太阳城集团本发明的其它目的、特征或优点将在以下描述中部分地阐述,并且对于本领 域普通技术人员而言在阅读本文的描述后将部分地变得显易见,或可通过实践本发 明获知。本发明的目的和优点将通过特别在发明内容和所附权利要求中指出的元件 和组合来实现和获得。此外,说明书中描述的优点,如果不包含在权利要求中,则 不是对所公开发明的本质的限制。

本文中示意性地描述的发明在缺少任何未具体在此公开的元件或诸元件、限 制或诸限制的情况下可被适当地实践。因此,例如,术语“包括”“包含”“具有” 等都应理解为是可扩展的和无限制的。另外,本文中所采用的术语和表达作为描述 的术语使用而不是限制,且并非旨在排除任何将来示出和描述的等效物或其任何部 分来使用这些属于和表达,并且认识到在本发明权利要求要求的范围内各种改变都 是可能的。因此,应理解:尽管本发明已通过优选实施例和可选特征具体地公开, 但本领域技术人员可采取本文所公开的本发明的更改和变化,并且这样的更改和变 化被视为在本文公开的发明范围内。在此已对本发明进行了广泛的和一般性的描 述。包含在上位公开范围内的狭义种类和亚属分类也形成这些发明的一部分。这包 括以某种条件或否定限制从类中排除了任何主题内容的对每一发明的一般性描述, 而与所排除的内容是否具体落入该一般性描述无关。

太阳城集团另外,发明的特征和方面按照马库什(Markush)组描述时,本领域技术人员将 认识到本发明因此也可以按照马库什组中任何单独成员或成员的亚组进行描述。 还应理解以上描述是为了说明而不是限制。阅读以上描述后很多实施例对于本领域 人员而言将变得显而易见。本发明的范围因此不应参考上述描述确定,而是应参考 所附权利要求和这些权利要求授权的整个等效范围来确定。所有文章和参考(包括 专利申请)的公开通过引用结合于此。

附图说明

图1是用于容纳本发明测试带的测试盒的一个示例的平面俯视图。

太阳城集团图2是本发明测试带的一个实施例的侧视图,其中样本施加在窗口1上。

太阳城集团图3是本发明测试带的另一实施例的侧视图,其中样本施加在窗口2上。

太阳城集团图4是本发明测试带的又一个实施例的侧视图,其中样本施加在窗口1和窗 口2上。

图5是本发明测试带的一个实施例的侧视图,和可与该测试带一起使用的测 试盒的俯视平面图,示出了测试带和测试带的能在测试盒中看见的各个部分之间的 对应性。

太阳城集团图6是本发明测试带的一个实施例的俯视图,示出了在窗口1施加样本和在 窗口2施加缓冲液后液体的双向流动。

太阳城集团图7是本发明测试带的另一个实施例的俯视图,示出了在窗口1和在窗口2 施加样本后液体的双向流动。

图8是测试带的总体类似于图3的另一实施例的侧视图,但在该实施例中样 本(至少对于通常通过窗口2施加至共轭物垫的样本)在到达样本过滤器前与共轭 物反应。

图9是测试带的总体类似于图4的又一实施例的侧视图,但在该实施例中样 本(至少对于通常通过窗口2施加至共轭物垫的样本)在到达样本过滤器前与共轭 物反应。

图10是测试带的总体类似于图3的再一实施例的侧视图,但在该实施例中, 在层析介质的第二端处堆叠在层析介质上的是共轭物垫、样本过滤器、以及液体收 集器,其中液体施加至共轭物垫,且液体收集器与层析介质接触。

太阳城集团图11是测试带的总体类似于图3的另一实施例的侧视图,,但在该实施例中, 在层析介质的第二端处堆叠在层析介质上的是共轭物垫、样本过滤器、以及液体收 集器,其中液体施加至共轭物垫,且液体收集器与层析介质接触。

太阳城集团图12是能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施对人类丙型肝炎病 毒(HCV)的间接测定的测试带的一个实施例的详细侧视图。

图13是能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施前列腺特异性抗原 (PSA)夹心测定的测试带的一个实施例的详细侧视图。

图14是能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施人类HIV特异性 抗体夹心测定的测试带的一个实施例的详细侧视图。

图15是能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施人类HIV特异性 抗体间接测定的测试带的一个实施例的详细侧视图。

图16是能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施人类HIV特异性 抗体和HCV特异性抗体间接测定的测试带的一个实施例的详细侧视图。

太阳城集团图17是能使用金抗-DNP抗体和DNP-BSA作为对照来实施乙型肝炎表面抗原 (HbsAg)和梅毒螺旋体抗原夹心测定的测试带的一个实施例的详细侧视图。

本发明的详细描述

太阳城集团本发明公开了侧向流测定方法和系统,该方法和系统包含测试带和/或用于容 纳该测试带的测试盒,用于测定样本中分析物的存在和/或数量,样本包括但不限 于生物材料或其它含样本材料,包含:抗原、抗体、激素和其它分泌性蛋白、细胞 表面蛋白、跨膜蛋白、糖蛋白、酶、与细胞或其它蛋白相关联的蛋白、与例如细菌、 病毒、霉菌的病原体相关的蛋白、碳水化合物、药物、肽、毒素、核素、小分子和 适体。这种新的测定或系统能检测和/或定量少量样本中的分析物。通常,采样量 小于约100μl。典型地,采样量小于约90μl。更典型地,采样量小于约80μl。 优选地,采样量小于约70μl。更优选地,采样量小于约60μl。仍然更优选地, 采样量小于约50μl。最优选地,采样量为约40μl。该测定或系统也能在样本中 将液体与细胞分离,诸如红细胞、或白细胞、或其它细胞类型。该测定或系统基本 上是与量无关的,从而不管样本中所存在的红细胞的细胞容积,例如红细胞容积的 变化如何,结果都是恒定的。该测定或系统还具有低背景干扰和高效率。

太阳城集团对于此处的使用,“分析物”指将通过使用本发明的侧向流测试带和方法所检 测的材料。“分析物”包含但不限于:抗原、抗体、激素(例如TSH、hCG、LH)、 药物、心脏标记物(诸如肌钙蛋白I、心肌型肌酸激酶同功酶(CKMB)、肌红蛋白、 C反应蛋白(CRP)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶同功酶BB(GPBB)、 B型利钠肽(BNP)和Pro-BNP、自身免疫性疾病标记物、肿瘤标记物(例如PSA、 CEA、α-胎蛋白)、与细胞相关联的蛋白(“细胞蛋白”)、分泌性蛋白、酶、细胞表 面或跨膜蛋白、糖蛋白和其它蛋白、与例如细菌、病毒、霉菌的病原体相关的蛋白 或碳水化合物、肽、毒素、核素、适体和碳水化合物。当在本文中使用时,分析物 还包含可被特异性非抗体结合蛋白(例如受体)检测的分子、以及可被特异性沃森 -克力克碱基配对(杂交)检测的核酸。其它分析物贯穿说明书作进一步描述。

本文中的“分析物结合剂”是特异性结合将要分析的样本中的分析物的分子。 “分析物结合剂”可以是抗体或抗原但并不局限于此。“分析物结合剂”包含生物 工程蛋白、肽、包含具有分析物结合部位的抗原的异类混合物的半抗原和溶菌产物。 在一个典型但非排他性的实施例中,分析物结合剂是用于结合要分析样本中抗原的 抗体、或用于结合要分析样本中抗体的抗原。如果分析物是核酸分子,则分析物结 合剂可以是例如通过沃森-克力克碱基配对的与其特异性结合的核酸分子,或者可 以是在序列-特异性相互作用基础上结合核酸序列的蛋白质。

在本文中使用时,术语“抗原”包含感染性抗原和其它微生物或其一部分, 诸如细菌、病毒、衣壳、核壳体、或者病毒、霉菌、蛋白感染素或寄生虫的其它部 分。感兴趣的分析物最好包含免疫原部分,从而针对用于检测目的部分可产生抗体。 细菌包含革兰氏阳性和阴性细菌,比如炭疽芽孢杆菌、大肠埃希杆菌、沙门氏菌属 类、志贺氏菌属类、鼠疫巴斯德(氏)菌、螺旋杆菌、霍乱弧菌、葡萄球菌类等。病 毒包含HIV、甲乙丙丁型肝炎病毒、单纯疮疹病毒、细胞巨化病毒(CMV)、埃博拉 病毒、绒毛状瘤病毒(例如HPV)、包含流感病毒的鼻病毒、SARS病毒、和牛痘 病毒。“抗原”还包含抗体能针对其产生的化合物或感染剂的免疫原部分。另外, 术语“抗原”也可包含要检测的抗体或可刺激抗体产生的微分子。例如,在检测人 免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)时,人类抗HIV抗体或抗HCV抗体 是要检测的抗原,例如通过抗-人IgG(免疫球蛋白G)。在检测例如风湿性关节炎、 桥本(氏)甲状腺炎、系统性红斑狼疮的人体自身免疫疾病的情况下,和在以对自身 抗原的异常抗体反应为特征的其它情况下,针对这样的自身抗原的人类抗体成为抗 原。

在本文中使用时,术语“抗体”包含多克隆或单克隆抗体、或足以结合感兴 趣抗原或分析物的片段。抗体片段可以是,例如,单节显性的Fab片段、单节显性 的Fab′片段、或双节显性的F(ab)′2片段。也在术语“抗体”的范围内的是:由抗 体工程产生的分子,例如单链抗体分子(ScFv);或由单克隆抗体产生的人源化抗 体或嵌合抗体,通过取代重链和轻链的恒定区可产生嵌合抗体,或者取代恒定区和 可变区的结构部分可产生人源化抗体。然而,在大多数情况下,不需要这样的更改 以产生适合与本发明一起使用的抗体。

在本文中使用时,术语“捕获带”指层析条上包含至少一种分析物结合剂的 区域或区带。分析物结合剂通常固定在带或区域内,从而在与可检测试剂反应后, 该带或区域产生可观察的或可测量的反应存在于样本中分析物的存在或数量的结 果。“捕获带”可包含用于捕获样本中一个以上分析物的一个以上捕获区域,在该 情况下可使用一种以上分析物结合剂。例如,被视为在本发明范围内的两种分析组 合是同时检测丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的测定的组合, 以及同时检测乙型肝炎表面抗原(HbsAG)和梅毒螺旋体抗原(TP)的测定的组 合。其它组合仍是可能的,并且在本发明的范围内。

在本文中术语“共轭物”和“可检测试剂”互换地使用,指共轭至诸如有色 试剂、荧光试剂或化学发光试剂的可检测材料的抗体或抗原。在本发明的实践中, “共轭物”或“可检测试剂”特异性地结合要检测的分析物,或固定在捕获带上的 所捕获的分析物。可任选地,“共轭物”或“可检测试剂”在捕获带上产生可测量 的定量读数,该读数反映捕获带上存在的分析物的量。如在以下进一步描述的,捕 获带内可直接测量的定量密度并不一定反映通过结合存在于捕获带内的分析物的 量,但RI(相对密度)确实反映捕获带处存在的分析物的量。

太阳城集团在本文中使用时,“可检测材料”指诸如在捕获带处可被共轭至抗原或抗体、 并且可被检测的任何材料。该材料可以是微粒、有色材料、荧光材料、化学发光材 料并可包含一种以上材料。如果使用一种以上材料,则可使用可能材料的任何组合。 例如,如果测定意欲检测一种以上分析物,则使用的可检测材料可以是在不同波长 处发荧光的荧光材料。微粒可以是如在美国专利No.6,136,610中所描述的带有或 不带有机或无机包衣的胶体金微粒、胶体硫微粒、胶体硒微粒、胶体硫酸钡微粒、 胶体硫酸亚铁微粒、金属碘酸盐微粒、卤化银微粒、硅微粒、胶态金属(含水的) 氧化物微粒等、蛋白质或肽分子、脂质体、或有机聚合物乳胶微粒(例如聚苯乙烯 乳胶珠)。微粒的大小可与层析条的孔隙率相关。

太阳城集团在本文中使用时,术语“对照带”包含固定在对照结合区域内的对照试剂。 对照试剂特异性结合至对照结合试剂以形成对照结合对,如在美国专利No. 6,136,610中所描述的,该专利通过引用结合于此。本发明通常包含两个对照带, 尽管并不要求使用两个对照带。两个对照带可相同或不同。具有对照结合对的一个 特别优点是它们作为内部对照起作用,即,对可在单个测试带上对比分析物检测结 果的对照。该对照可用于校正条与条之间的变化。对照之一可指定为高对照 (“HC”),而对照中的另一个可指定为低对照(“LC”)。当使用两个对照时HC与 LC的比通常被预定为内部质量对照之一。另外,HC或(可选地)LC的反映密度 可用于确定测试带(分析物)的RI(相对密度)。对于任何定量测定,都根据系列 浓度标准试剂的RI来制定标准曲线。在定量测定时,根据信号/截断(S/C)的RI 的比检测数量,而截断根据大量阴性样本来确定。尽管通常本文中可使用任何常规 的对照,但通常优选将不存在于样本中或不会与存在于样本中的化合物发生交叉免 疫反应的化合物作为对照;例如,可购自Molecular Probes(Eugene,OR,cat#A-23018) 的2,4-地乐酚苯醚小牛血清白蛋白可用作对照试剂。化合物2,4-地乐酚苯醚是不存 在于人体内但作为半抗原起作用的小分子;即,当结合至较大分子(例如蛋白质载 体)并注射进入抗体产生哺乳动物时它具有免疫原性,所述哺乳动物例如鼠、大鼠、 牛、兔、马、绵羊或山羊。

术语“有效接触”在本文中应用如下:两个固体组分在它们以如下方式或直 接或间接接触时是有效接触:液体可通过毛细管现象或其它方式从两组分之一几乎 不间断地流至另一个。“直接接触”表示两组分为物理接触,例如边缘-至-边缘或 前方-至-后方。“间接接触”表示两组分没有物理接触,而是由一个或多个传导手 段桥接。这种通过一个或多个传导手段的桥接可以是边缘-至-边缘或前方-至-后方 的。在本文中使用时,术语“毛细作用接触”等同于有效接触。

用于检测诸如PSA(前列腺特异性抗原)或TSH(甲状腺刺激激素)的分析 物的“直接测定”意为夹心测定法。例如,对于PSA的测定,带标记的抗PSA抗 体与存在于样本中的PSA反应以形成复合物。该复合物在捕获带上检测,该捕获 带可涂上或PSA抗原或PSA抗体。如果抗原是聚集的或包含相同抗原决定簇(抗 原定子)的多重拷贝,并且想要在捕获带上将抗体结合至测试带,则分析物的特异 性第一和第二抗体可以是等同的。否则,第一和第二抗体是结合至分析物上不同抗 原决定簇的两种抗体。在夹心测定中,样本可被加至设备的孔1和孔2两者中,如 下所示。可任选地,在使用单向流以提供信号的测定中,样本可只被加入孔1中。

太阳城集团在用于例如抗-HIV抗体的“间接测定”中,样本被加至孔1,并且当样本在 检测带上向下流过层析条时,样本中的抗-HIV抗体结合至检测带中的HIV抗原。 当缓冲液被加至孔2时,它溶解向上流过层析条并结合至与检测带中HIV抗原特 异性结合的人类抗体的抗-人IgG-金共轭物。在这个间接测定形式中,样本总是加 在设备的孔1中,如下所示。

在本文中使用时,“停流”测定是其中第一方向的流停止的测定。在停流中, 加入孔1的液体(样本或缓冲液)是以相对较小量加样的,从而没有足够的液体流 过硝基纤维素膜,并且在流到达带标记的试剂(共轭物)之前流停止。实现停流测 定的目的是预湿润硝基纤维素膜,封闭某些非特异性蛋白结合位点以及确保硝基纤 维素膜表面上的化学物质在标记试剂流进这些区域之前均匀地分布。这是与“逆流” 测定相对照的。在逆流测定中,较大量的液体被加至孔1从而这种液体能够流回。 对于逆向流测定,测试盒被构建为:当正确量的样本被加至孔1时,液体沿带朝孔 2流下,经过对照和检测区域,然后终止,然后逆向朝吸收垫流回。然后样本被加 至孔2,并沿带朝吸收剂垫向上流。另外,使用根据本发明图3和4中的设备可实 施双向流测定形式。在双向流动析形式中,液体通常通过孔1和孔2顺序地加至硝 基纤维素膜或其它层析介质的两端,并且在硝基纤维素膜内两个方向上都出现了 流。

应理解前面一般描述和以下详细描述只是示例性的和阐述性的,而并不像权 利要求所要求地限制本发明。此外,必须理解本发明不局限于所描述的具体实施例, 具体实施例当然是可变的。另外,用于描述具体实施例的术语并不是为了作出限制, 因为本发明的范围将仅由它的权利要求来限制。

另外,虽然本发明可单独使用、或与任何适于人工或自动读取结果的分析设 备一起使用,但在本文中本发明使用美国专利No.6,136,610中的装置和盒为例, 并且在本发明的一个实施例中,使用了美国专利No.6,528,323中的双向流机构。 应理解本发明并不局限于使用这样的装置或盒。

太阳城集团太阳城集团值的范围,本发明包含该范围上限和下限之间的每一中间值到下限单位 的至少十分之一,除非上下文另外明确提示。而且,本发明包含任何其它规定的中 间值以及包含范围上限和下限的两者之一或两者的范围,除非它们从规定的范围内 被特别排除。

除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语的意义是本发明所属领域 技术人员通常理解的。本领域技术人员也将理解任何与本文中所描述相类似或等同 的方法和材料也可用于实践或检测本发明。

本文所讨论的出版物或专利只是因为它们的公开先于本申请的提交日期而提 供。此处决不能解释为承认本发明不会先于已有发明的出版物而授权。此外出版物 提供的日期可能与实际出版日期不同,该实际出版日期可能需要单独确认。

所有引用的出版物通过引用全部结合于此,包含所有已公开专利、专利申请、 文献参考以及已结合在那些公布文献中的那些出版物。然而,任何通过引用结合于 此的出版物指即将公布的太阳城集团,申请人不承认本发明提交日期之后公布的太阳城集团是现 有技术。

太阳城集团如在本说明书和所附权利要求中所使用的,单数形式包含复数形式。例如术 语“a”“an”和“the”包含复数范围,除非上下文另外明确提示。因此,除非另 外提示,“一样本过滤器”包含一个或多个样本过滤器。可任选地,缓冲液垫可置 于任何样本过滤器或样本过滤器集合上。这应用于以下描述的所有实施例。

参看图1,图1是可与本发明的测试条一起使用的现有技术测试盒(1)的平 面俯视图,测试盒(1)有两个窗口。窗口1(2)可用于夹心法的加样,例如应用于 乙肝表面抗原(HbsAg)的检测;或者可用于间接法双向横流检测中对分析物的检 测,例如人体免疫缺陷病毒(HIV)抗体。窗口2(3)可用作夹心法测定中的加样窗 口,或者可用作加试剂的窗口,例如间接法双向流检测中的缓冲液。测试盒(1) 还包含一个检测窗口(4)用来观察试验结果。通过观察检测窗口(4),可观测到用于 待检测分析物的捕获带(5)-此分析物在本例中标记为人体免疫缺陷病毒(HIV), 同时还可观测到第一条对照带(6)——此带在本例中标记为HC,和第二条对照 带(7)——此带在本例中标记为LC。为便于管理测试类型、产品有效期、和批 间变化的调整,测试盒(1)还可有选择地包括条形码(8)。

太阳城集团在本发明中,如果使用了图1所示的测试盒,则窗口1(2)或窗口2(3)各自可 用来添加样本或者试剂,具体如下所述。

太阳城集团参看图2,图2是本发明一实施例的测试条的侧视图。在本实施例中,如图2 所示,在层析条(9)的第一端(10)有一个样本过滤膜(12)置于窗口1(图1 的2),窗口2(图1的3)上设置有缓冲液垫(14)。缓冲液垫(14)设置在共轭物垫 (13)的上面,该共轭物垫(13)含有至少一种可流动的可检测试剂,通常称为“共 轭物”,共轭物特异地与分析物结合、或与一个结合了分析物的试剂结合。比如, 这样的共轭物可以是偶合了胶体金的分析物特异抗体或分析物特异抗原。可任选 地,共轭物垫(13)还可包含与一个或多个对照带(6,7)上的固定对照试剂特异 结合的第二个可流动的可检测试剂,比如如图6所示。对于全血测定,样本过滤器 (12)包含有一种凝集素用来与全血样本中的红细胞凝集。第一个样本吸收垫(15) 设置在第一端(10),在样本过滤器(12)的远离化学共轭物垫(13)或缓冲液垫 (14)的一侧靠近样本过滤器(12)。也可以使用与第一个吸收垫(15)毛细作用 接触的第二个可任选吸收垫(16).。第二个吸收垫(16)(如果存在)可直接置于 第一个吸收垫(15)之上或与第一个吸收垫(15)重叠。第一个吸收垫(15)和层 析条(9)的第一端(10)有毛细作用接触或者重叠。可任选地使用一个塑料衬垫 (17)来支撑层析条(9)。层析条(9)还包含针对每一种要检测分析物的至少一 条捕获带(5)和一条或者多条对照带(6,7),比如如图6所示。每条捕获带(5) 上都包含有一种固定的抗体或者抗原,此抗体或抗原特异性地与样本中要检测的分 析物发生反应。每条对照带(6,7)中任选地都包含着一种固定的抗体或抗原,此 抗体或抗原与样本非特异性地发生反应,或者与共轭物垫(13)上的其他对照试剂 发生特异性反应。

太阳城集团在用图2所示的形式进行间接测定的过程中,含全血的样本被加到窗口1(2) 的样本过滤器(12)上,如图6所示。红细胞滞留在样本过滤器(12)上,而样本 中的液体从样本过滤器(12)流到层析条(9)的第一端(10),再从第一端(10) 沿第一侧流方向流向第二端(11)。在第一次液体流动的过程中,样本液体流过捕获 带(5),捕获带(5)在艾滋测试条中含有HIV抗原或在丙肝测试条中含有HCV 抗原,它们分别与样本中的诸如HIV抗体或者HCV抗体的分析物反应的。在第一 次液体侧向流动的过程中,液体还会通过对照带(6,7)。更进一步地,第一侧向流 方向(21)的液流,在最靠近共轭物垫的对照带(7)和共轭物垫(13)之间需要并 明显地停止流动。样本中的分析物(如果存在)会在液体流动的过程中主要沿第一 侧流方向(21)被捕获带(5)捕获,在测试带(5)上形成第一个免疫复合物,诸 如HIV-抗人类HIV抗体复合物。全血样本中存在的一些分析物和其他抗体,可 在一条或者多条对照带上非特异性地结合。然后向缓冲液垫(14)添加缓冲液,以 释放共轭物垫(13)里的共轭物。在一实施例中,所释放的共轭物中包含至少一种 或者两种带标记试剂,一种与测试带(5)上的第一个免疫复合物特异性反应,比 如带标记的抗人IgG,以及可任选的,一种与对照带(6,7)上的对照试剂发生反 应。所释放的共轭物再从层析条(9)的第二端(11)沿着第二侧流方向(22)向 第一端(10)流动。在第二侧流方向(22)的液体流动过程中,在对照带(6,7) 上形成一种带标记对照结合试剂和对照试剂的可检测复合物,在捕获带(5)上形 成带标记的抗人IgG抗体和第一免疫复合物的第二个可检测免疫复合物。在间接 测定中,允许在第一次流动期间样本中的分析物和捕获带(5)上的捕获试剂之间 发生反应形成第一免疫复合物,以在第二次流动期间检测。

太阳城集团值得注意的是,当如图2的测试带配置被用于诸如血清或者血浆样本的非全 血样本中分析物的测定时,样本过滤器(12)中不需要包含凝集素。这样的配置可 用于夹心测定和间接测定。在夹心测定中,比如乙肝表面抗原(HBsAg)的检测中, 如果要达到最佳性能则需要样本或者是缓冲液(在乙肝表面抗原(HBsAg)夹心测定 的情形中,血清样本可被同时加入窗口1和窗口2,也可只加入窗口2)。如根据 本发明的测试带执行的夹心测定和间接测定的区别如下。间接测定的定义是,带标 记的试剂并不与分析物直接发生反应,而是与免疫复合物发生反应。例如,如果在 乙肝表面抗原(HBsAg)的测试中在窗口2加样,则在测试带上涂上一种乙肝表面抗 原抗体,另一种乙肝表面抗原抗体被标记和涂在共轭物垫上,当在窗口2加样时第 一免疫复合物形成,然后在测试带捕获以形成夹心,用于固定和标记的化学试剂都 是同样的抗体或者抗原(即使抗原决定基不同)。另一方面,在如HIV或HCV抗 体测试的间接测定中,捕获带中的固定试剂(HIV或HCV抗原)和共轭物垫上的 带标记试剂(如抗人IgG)不是同一反应物。固定捕获试剂直接与分析物反应,带 标记试剂与分析物和捕获试剂的复合物反应。如图6所示,向窗口1(2)的样本 过滤器(12)加样。液体将从样本过滤器(12)流到层析条(9)的第一端(10), 再以第一侧流方向(图6的21)从第一端(10)流到第二端(11),通过捕获带(5) 和对照带(6,7);液体在到达共轭物垫之前停止流动(见“停流”模式),或者可任 选地,流体可流入共轭物垫(13)并溶解共轭物(如果期望改进测定的执行)。通 常情况下,在根据本发明的测试带进行的测定中,特别是间接测定中,最好使用停 止流动模式,即不允许流体流过共轭物垫并接触共轭物,尤其是在间接测定(抗体 检测)中,因为样本中的抗体将与共轭物中带标记的抗人IgG(或IgM)反应,在 共轭物到达捕获带之前形成免疫复合物。这样就会产生假阴性的结果。因此,在间 接测定中,从窗口1流出的流体不能与共轭物接触。然而,在夹心测定中,停止流 动模式则不是必须的。

因此,在一实施例中,来自样本的液体在对照带(7)和共轭物垫(13)之 间停止了沿第一次侧流方向(21)的流动。如果在样本中发现了正在检测的分析物, 例如乙肝表面抗原,则它将在包含比如固定的人抗乙肝表面抗原抗体(“固定捕获 抗体”)的捕获带捕获。在液体在第一侧流方向上流动的过程中,在捕获带(5)上 形成了第一个免疫复合物,比如乙肝表面抗原和乙肝表面抗体的复合物。再一次, 在液体在第二侧流方向(22)上流动的过程中,如果在第一次流动后样本中还剩有 未结合的分析物,那么在第二次流动的过程中将会形成其它的第一免疫复合物。

样本的第二份试样被加到缓冲液垫(14);在这个格式中,缓冲液垫含有红细 胞凝集素。样本中的细胞被留在缓冲液垫,而来自样本的液体流过共轭物垫(13), 共轭物被释放。共轭物包含有与样本中分析物反应的第一种带标记的可流动试剂, 例如共轭于一种例如胶体金的可检测试剂的带标记的人抗乙肝表面抗原抗体。可任 选地,共轭物包含与对照带(6,7)中的对照试剂发生反应的第二种可流动试剂。 在液体在第二侧流方向(22)流动的过程中,如果样本中含有分析物,则诸如带标 记的抗人乙肝表面抗原抗体和乙肝表面抗原的第二种免疫复合物将形成,就从层析 条(9)的第二端(11)在第二侧流方向流到第一端(10)。当液流第二侧流方向继 续时,带标记的对照粘合试剂和对照试剂的可检测复合物在对照带(6,7)形成; 并且在捕获带(5)上形成包含第一和第二免疫复合物的可检测的第三免疫复合物。 双向侧流有利于冲掉捕获带和对照带上的污染物,从而减少背景干扰。

图2的形式可用来检测血清或血浆样本中分析物的间接测定。在这种形式中, 样本过滤器(12)中可任选地不含凝集素。测定首先通过向窗口1(2)添加缓冲 液或者其他液体试剂来预湿层析条(9)。然后向窗口2(3)添加血清或血浆样本。 来自样本的液体从共轭物垫释放共轭物。样本中的分析物(如果存在)将与共轭物 反应形成第一对抗原抗体结合体,即第一免疫复合物。第一免疫复合物与样本液体 一起按第二侧流方向流到捕获带(5)和对照带(6,7)。第一免疫复合物在捕获带 (5)上在第二次抗原抗体反应时被捕获以生成第二对结合物,即第二免疫复合物, 该复合物可被检测到并定量。

与上面所述的实施例(未示出)有所不同,不使用共轭物垫(13),并且固定 的可检测试剂在第二端(11)结合于层析条(9)。在该实施例中,窗口2(图1的 3)设置有缓冲液垫(14),位于层析条(9)的顶端或者与层析条(9)重叠。缓冲 液垫(14)可置于固定的可检测试剂的上方。

在上述实施例的另一种变体(未示出)中,不使用缓冲液垫(14),共轭物垫 (13)设置于层析条(9)的第二端的上方或与之重叠。可直接向共轭物垫(13)添 加缓冲液。

在又一实施例中,如图3所示,该测试条适于实现夹心测定,诸如用于检测 乙肝表面抗原和用于检测对梅毒螺旋体即梅毒病原体的抗体。在这种形式下,还有 第二个样本过滤器(18),一个液体收集器(19),可任选的一个共轭物垫(13),都置于 层析条(9)的第二端(11)。在层析条(9)的第一端(10)还设置有一个第一样本过滤器(12) 和至少一个吸收垫(15)。第一个吸收垫(15)置于第一个样本过滤器(12)的上方。图4 示出了一个变体,其中第一个和可任选的第二个吸收垫放置成在层析条(9)的第一 端(10)靠近样本过滤器(12)。图4的形式适于执行夹心测定,诸如对前列腺特异 性抗原(PSA)和促甲状腺激素(TSH)的测定。

太阳城集团在如图3所示的实施例的一个变体(该变体未示出),不使用共轭物垫,但在层 析条(9)的第二端(11)上结合有可流动的可检测试剂。在这种结构下,液体收集器(19) 直接与层析条(9)有毛细作用接触,液体收集器可被完全设置在层析条(9)的第二 端(11)的上方,或者与层析条重叠。

如图3所示的实施例的另一个变体(图上未示出),用样本垫来代替第一个样 本过滤器来施加诸如缓冲液的试剂。样本垫包含能承载足以进行测定的缓冲液的吸 收材料。

太阳城集团在使用图3和图4形式的测定的操作过程中,含有全血的样本被加到图1的 窗口1(2)和窗口2(3)。在这个形式里,第一个样本过滤器(12)和第二个样本过 滤器(13)最好是可过滤掉红细胞的全血过滤器。图7示出使用图4的实施例来进行 夹心测定。向层析条(9)的第一端(10)向第一个样本过滤器(12)加入含红细胞的样本。 来自样本的液体沿第一侧流方向从第一端(10)流到第二端(11),途中流经捕获带(5) 和对照带(6,7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)被捕获,从而分析物-抗体在捕 获带(5)上形成第一免疫复合物。然后向窗口2(3)上的第二样本过滤器(18)加 入同一个样本的第二试样。来自第二样本过滤器(18)的液体经过液体收集器(图4 的19)和共轭物垫(13)到达第二端(11),然后再沿第二侧流方向(22)从第二端(11) 向第一端(10)移动,途中经过捕获带(5)和对照带(6,7)。分析物(如果存在)将在捕 获带(5)上被检测试剂(诸如抗体)捕获,从而分析物-抗体复合物形成夹心。在 这个形式里,加入窗口2(3)的分析物(例如乙肝表面抗原)首先与来自共轭物 垫的共轭物结合,例如带标记的乙肝表面抗原抗体,比如共轭于胶体金的乙肝表面 抗原抗体,以形成分析物-共轭物的复合物,然后该复合物流到捕获区、并与固定 在捕获区上的乙肝表面抗原抗体发生反应,在那时加到窗口1(2)的样本也已捕 获到了乙肝表面抗原。

在一种变体中,可省去向样本过滤器(12)的第一端(10)添加样本的步骤,并 且样本可直接向窗口2(3)上的第二个样本过滤器(18)添加。在这种形式下, 首先向窗口1加缓冲液以预湿测试带,从而缓冲液按第一次侧流方向(21)由第一 端(10)向第二端(11)流动。接着向窗口2(3)加样。来自样本的液体经过液 体收集器(19)和共轭物垫(13)到达第二端(11),然后再从第二端(11)沿第二 侧流方向流过捕捉带(5)和对照带(6,7)。样本中的分析物和共轭物结合以形成复合 物,复合物然后流向捕捉带和对照带。分析物-共轭物复合物在捕获带(5)上被捕获, 从而形成夹心。

值得注意的是,当如图3或图4的测试带结构用于诸如血清或者血浆样本的 非全血样本中分析物的测定时,图3中的样本过滤器(18)或者图4中的样本过滤器 (18或12)不包含凝集素。这种结构既可用于夹心测定也可用于间接测定。

样本过滤器(12)放置在层析条(9)的第一端(10)上,从而在诸如从图1测试盒 的窗口1(2)向样本过滤器(12)加样时,样本中的液体将会从样本过滤器(12)流到 层析条(9)的第一端(10),并沿第一侧流方向从层析条(9)的第一端(10)流到第二 端(11)。样本过滤器(12)中可任选地包含与去除某种物质相关的凝集素试剂,诸 如从样本中过滤掉细胞。例如,如果样本含有红细胞,则凝集素就可以是抗红细胞 抗体或者是任何可凝集红细胞的血凝素。含有此类凝集素的样本过滤器统称为“全 血过滤器”。这些可选方案描述如下。

太阳城集团在本文中使用时,“样本垫”以及“样本过滤器”指的是可用来承载样本,如全血 样本、血清或者血浆的元件。术语“样本垫”是指可用来承载样本的吸水性元件, 例如亲水性的膜。当样本是全血或者可以是全血时,样本垫中可包含上述的凝集素。 术语“样本过滤器”一般指可类似地用于承载样本的疏水性元件,比如玻璃纤维过 滤器。样本过滤器也可包含如上所说的凝集素。然而,样本过滤器也可以是亲水性 元件,比如用抗红血球抗体或其他凝集素预处理的样本垫。在本文中使用时,术语 “全血过滤器”指的是含有凝集素的样本过滤器。然而,当图2的测试带配置用来测 定除全血样本外的其他样本中的分析物时,诸如血清、血浆或者其他生物制剂,过 滤器(12)上不需要凝集素。这个配置可适用于夹心测定和间接测定。在夹心测定中, 例如乙肝表面抗原的测定中,如图6所示,为了达到最好的效果,将样本或者缓冲 液加到窗口1(2)上的样本过滤器(12)。在例如乙肝表面抗原这种夹心测定中, 可向窗口1和窗口2加样,也可以只向窗口2加样。液体将会从样本过滤器(12)流 到层析条(9)的第一端(10),再以第一侧流方向从第一端(10)流到第二端(11), 通过捕获带(5)和对照带(6,7);液体在到达共轭物垫(13)之前停止流动(“停止 流动”模式),或者可任选地,如果需要改进实验效果,则液体流入共轭物垫(13) 并溶解共轭物。在间接测定中停止流动模式特别适用,因为样本中的抗体被排除与 共轭物中的带标记的抗人IgG或者IgM相互作用,从而在共轭物流到捕获带之前 就形成复合物,从而导致假阴性结果。

在本发明的一个实施例中,共轭物垫(13)置于层析条(11)的第二端,而缓冲 液垫(14)置于共轭物垫(13)的上方。在该实施例中,共轭物垫(13)与层析条(9)的 第二端(11)交迭,交迭的距离足以供液体从缓冲液垫(14)流过共轭物垫(13)到达 层析条(9)上。交迭的距离可以是大约0.5mm到大约10mm之间,通常情况下为 大约1mm到大约8mm,较佳的是大约2mm到大约5mm,更佳地为大约2mm 到3mm。

太阳城集团缓冲液垫(14)可以是任何合适大小,只要它能如上所述吸收或承载足够量 的液体来溶解共轭物垫(13)里或者层析条(9)上的可检测试剂即可。在一实施例中, 缓冲液垫比共轭物垫大。在另一实施例中缓冲液垫与共轭物垫一样大。在又一实施 例中,缓冲液垫比共轭物垫小。

太阳城集团在本发明的另一实施例中,不使用共轭物垫(13),并且当使用共轭物垫时,通 常出现在共轭物垫上的可检测试剂被结合到层析条(9)的第二端(11)。在这种实 施例中,缓冲液垫(14)置于层析条(9)的上方。在一可选方案中,缓冲液垫(14) 与层析条(9)的第二端(11)交迭,交迭的距离足以使缓冲液垫(14)上加入的 液体通过毛细作用流到层析条(9)上以溶解层析条(9)第二端(11)上存在的可 检测试剂。在另一可选配置中,缓冲液垫(14)可置于缓冲液溶解层析条(9)第 二端(11)的正上方,例如层析条(9)第二端(11)中可检测试剂的上方。在该 实施例中,添加到缓冲液垫(14)上的液体可溶解可检测试剂,使可检测试剂从层 析条(9)的第二端(11)按第二流动方向向层析条(9)的第一端(10)移动。如 果缓冲液垫(14)和层析条(9)交迭,则该交迭可在大约0.5mm到大约10mm之 间的范围内,通常情况下为从大约1mm到大约8mm,较佳的是从大约2mm到 大约5mm,最佳为大约2mm到3mm。

太阳城集团第一个吸收垫(15)置于层析条(9)的第二端(10)上,在远离共轭物垫(13) 或者缓冲液垫(14)的一侧靠近样本过滤器(12)。还可设置与第一吸收垫(15)有毛细 接触的第二吸收垫(16)。在一实施例中,可任选的第二吸收垫(16)置于第一个吸收 垫(15)的正上方。第一个吸收垫(15)与层析条(9)的第一端(10)交迭,交迭的距 离足以使流体从层析条(9)向吸收垫流动。该距离为大约0.5mm到大约10mm之 间,通常情况下为大约1mm到大约8mm,较佳的是大约2mm到大约5mm,最 佳为大约2mm到3mm。此外,可任选地使用第三吸收垫。

即使某些层析条已经设置有背衬部分,也可任选地使用衬垫(17)来支撑层 析条(9)。

太阳城集团在本发明的一个实施例中,如图3所示,至少一个吸收垫(15)与第一样本 过滤器(12)有毛细接触。可任选地,在第一吸收垫(15)的上方设置第二吸收垫 (16)。在一个实施例(图3)中,这两个吸收垫(15,16)都置于第一样本过滤器 (12)的上方,但并不会阻挡向第一样本过滤器(12)加样本或者其他试剂。可任 选地,还可使用第三吸收垫。

太阳城集团在本发明的另一实施例中,如图4所示,吸收垫(15,16)放置成在层析条(9) 的第一端(10)靠近第一样本过滤器(12),在第一样本过滤器(12)的与样本过 滤器(18)相反的一端。如上所述,第一样本过滤器(12)通常是包含凝集素的全 血过滤器。但是,如以下所述,如果向窗口1添加缓冲液,则可用样本垫来取代第 一个样本过滤器(12)。该样本垫可如上所述是亲水性的,也无需如上所述必须用 抗红血球抗体或者其他凝集素进行预处理。

图4的配置尤其适用于执行免疫夹心测定,例如对前列腺特异性抗原(PSA) 或者促甲状腺激素(TSH)的测定。

太阳城集团如图3或图4的装置可用几种模式操作。在那些模式之一中,向窗口1和窗 口2加入(全血)样本。当全血作为样本加入窗口1和窗口2时,第一样本过滤器 (12)和第二样本过滤器(18)最好都是全血过滤器以阻止红细胞(尤其是红血球) 进入层析条。或者,向窗口1加缓冲液,窗口2加作为样本的全血。在这种可选方 案中,第一样本过滤器(12)就无需是全血过滤器,即它不必含有凝集素。但是一般 情况下,最好第一样本过滤器(12)和第二个样本过滤器(18)都是全血过滤器,而 不管在进行测定时向窗口1加的是样本还是缓冲液。

在使用图3和图4的形式进行测定时,向图1的窗口1和窗口2填加含全血 的样本。在这种形式下,第一样本过滤器(12)和第二样本过滤器(18)最好都是可 以过滤红细胞的全血过滤器。图7示出了用图4的实施例进行夹心测定的操作。向 层析条(9)的第一端(10)使的第一样本过滤器(12)上添加含红细胞的样本。来 自样本的液体沿第一侧流方向从第一端(10)向第二端(12)流动,途经捕获带(5) 和对照带(6,7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获,分析物-抗体在捕获 带(5)上形成了第一免疫复合物。向窗口2(3)上的第二样本过滤器(18)添加同 一样本的第二试样。来自第二样本过滤器(18)的液体经过液体收集垫(图4的19) 和共轭物垫(13)到达第二端(11),然后再沿第二侧流方向从第二端(11)再流到第 一端(10),途经捕获带(5)和对照带(6,7)。分析物(如果存在)在捕获带(5)上被检 测试剂(例如抗体)捕获,从而分析物-抗体的复合物形成夹心。在这种形式下, 添加到窗口2(3)的分析物(例如乙肝表面抗原)将首先与来自共轭物垫的例如 带标记的抗乙肝表面抗原抗体(例如共轭于胶体金的的抗乙肝表面抗原抗体)的共 轭物结合,以形成分析物-共轭物的复合物。然后该复合物向捕获区流动,并与固 定在捕获区上的抗乙肝表面抗原抗体反应,此时也已经从加到窗口1(2)的分析物中 捕获了乙肝表面抗原。

在一变体中,可省略向第一端(10)上的样本过滤器(12)添加样本的步骤, 而直接将样本添加到窗口2(3)的第二样本过滤器(18)上。在这种形式下,先 向窗口1添加缓冲液以预湿测试带,缓冲液沿第一侧流方向(21)从第一端(10) 向第二端(11)流动。然后向窗口2(3)加样。来自样本的液体沿第二侧流方向 (22)经过液体收集器(19)和共轭物垫(13)流向第二端(11),并从第二端(11) 沿第二侧流方向(22)流过捕获带(5)和对照带(6,7)。样本中的分析物与共轭 物组合以形成复合物,该复合物再流向捕获带和对照带。分析物-共轭物复合物将 在捕获带(5)上被捕获,并形成夹心。

值得注意的是,当如图3或图4中的测试带配置用于测定诸如血清或者血浆 样本的非全血样本中的分析物时,图3中的样本过滤器(18)或者图4中的样本过滤 器(18或12)不包含凝集素。这种配置既可用于夹心测定也可用于间接测定。

太阳城集团根据本发明的测试带可被配置成实现采用单向流动或双向流动的测定。在本 文中使用时,“单向流动”是指只在测试带的一个部位加样,通常情况下为窗口1。 “单向流动”的概念中包括诸如“停止流动”的模式,即只加在测试带一个部位的 液体在层析介质的某一点停止流动;或者是“逆向流动”模式,即加在测试带的一 个部位上的液体在进行测定期间在层析内逆向流动。本领域普通技术人员可通过适 当选择加样到测试带的液体的量和测试带吸收材料的大小以及吸收性能来选择这 些操作形式。在“双向流动”中,在测试条的多个部位加样,通常为窗口1端和窗 口2;液体在双向流动的过程中(即第一次流动方向和第二次流动方向)有足够的毛 细梯度。

本发明所涉及的材料和测试带成分的设置使本发明有了独特的优点,从而可 使用较少量的样本,有效地过滤包括红细胞的细胞,有效地溶解可检测试剂,并能 得到测定分析物的存在和量的一致结果。

为了构建本测试带,本发明的层析条(9)可由任意具有高蛋白结合能力和支持 侧流测定的适当材料构成。一般来说,层析条(9)为亲水性膜,且蛋白结合为非 共价结合。尽管发明人并不旨在为下述理论所限制,目前太阳城集团蛋白质和硝化纤维膜 的结合理论是这样表述的,最初的交互作用是静电的,但随后的疏水交互作用和氢 键则被认为是增强了结合。层析材料的一个示例是常用的硝化纤维膜,对其已作了 处理使之成为疏水性材质,例如由Millipore Corporation(Billerica,MA)制造的一种 硝化纤维膜。层析膜的另一个示例是由某种聚合体的微粒(诸如聚乙烯)熔合在一 起。这些微粒可以是球形微粒。POREX公司(POREX Corporation,Fairburn,GA) 生产的POREX Lateral-Flo膜就是这种类型的膜。层析条的尺寸可以为任何适于实 验仪器或装置读取数据的尺寸。例如,为了与美国专利No.6,136,610的装置一起 使用,层析带的大小为大约5mm×44mm。当将例如HIV抗原或者HCV抗原的抗 原涂在层析条上时,这些抗原最好涂在含有海藻糖的溶液里。溶液中海藻糖的合适 浓度为1.0%。可稳定诸如硝化纤维上的固定抗原的其它复合物是众所周知的。

当抗原或者抗体涂在层析条(9)上时,由于其多孔性,蛋白质溶液将自身溶 解到硝化纤维膜的整个厚度中。蛋白质与气孔表面结合。由于这种加样方法和结合 的物理特性,与被提馏溶液浸湿的其他区域相比,更多的蛋白质在线的上部和中心 被结合。

本发明所指的层析条(9)包括至少一条用来捕获分析物的捕获带和至少一条对 照带,以及可任选的第二条对照带。当结合图1的测试盒使用时,可从测试窗口(4) 中看到捕获带和一条或多条对照带。捕获带包含能捕获样本中的分析物(如果存在) 的材料。例如,如果侧流测定旨在测量血液样本中的乙肝(HBV)表面抗原 (HBsAg),则捕获带将包含固定在层析条上的乙肝(HBV)表面抗原(HBsAg) 的抗体。如上所述,两条对照带之一是高对照带(HC),而另一条则为低对照带(LC)。 在本发明的一个实施例中,层析条(9)将在第二端(11)另外包含共轭物或者用 来检测所捕获的分析物的其他可检测试剂。

在图2所例示的实施例中,样本过滤器(12)最好是疏水性膜,或者是亲水 性膜,或者是比如通常用于侧流测定中加样的人工合成膜。这样的样本过滤器的示 例,包括但不仅限于以下几种:疏水性过滤器,例如玻璃纤维过滤器(Ahlstrom Filtration,Inc.美国宾州Mount Holly Springs);合成过滤器,比如Cytosep(Ahlstrom Filtration或者Pall Specialty Material,Port Washington,NY);以及亲水性过滤器, 比如纤维素(Pall Specialty Material)。在一实施例中,单个样本过滤器就足够了。在 另一实施例中,可使用一个以上样本过滤器。本样本过滤器(12)不需要使用成核 剂或者成核粒子。然而,样本过滤器也可包含凝集素,例如某种抗体或者化学复合 物。当该测定作为双向侧流测定进行时,即只向窗口1(2)加样时,而且有例如 TWEEN 20的非离子清洁剂存在于用于释放或溶解共轭物的缓冲液中时,凝集素就 不一定是必需的。释放共轭物的缓冲液中清洁剂的浓度应最少为大约0.1%。清洁 剂和共轭物释放缓冲液的结合有利于从捕获带和对照带冲走红细胞或者溶解了的 红细胞,并减少分析物和样本过滤器的非特异性结合。图3和图4设备中的样本过 滤器(12,18)相似地构造。

太阳城集团在图3和图4中所例示的实施例中,第二样本过滤器(18)通常是疏水性膜, 例如玻璃纤维膜(Ahlstrom Filtration,Inc)。在本实施例的一方面中,该第二样本 过滤器(18)包含一凝集素。在本实施例的另一方面中,在加入该凝集素之前,对 该疏水性器用某种非离子清洁剂进行处理,例如用浓度为大约0.002%的土温20 (TWEEN20)。第二样本过滤器可用于向图1中试剂盒(1)的窗口2(3)加样。

样本过滤器(12,18)的适当尺寸可以是适于在特定参数范围内的测试条。例 如,与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用时,样本过滤器的尺寸为大约5 mm×8mm。在一种实施例下,当样本过滤器(12,18)中含有凝集素时,最好在加 入凝集素之前用清洁剂,例如非离子清洁剂(比如浓度大约为0.002%的TWEEN20) 进行预处理。

本发明的凝集素通常包括针对需要被过滤掉的细胞或者其他物质的抗体。例 如,如果需要过滤掉的物质是血细胞,则本发明的凝集素包括抗红细胞抗体或者抗 白细胞抗体。该抗体可涉及一种细胞表面抗原。例如,抗红细胞(抗-RBC)抗体 包括抗红细胞膜抗体,例如抗带3抗体或者抗血型糖蛋白抗体(例如抗血型糖蛋白 A抗体)。这些抗体可在市场上买到,例如适于测定的一定浓度的兔抗人红细胞抗 体(中国厦门Buo-shen Biotech)或者鼠抗人红细胞抗体(中国安徽Rui-Tai-En Scientific LLC),浓度的范围为大约0.1mg/ml到大约1mg/ml,通常情况下为 0.2mg/ml到大约0.8mg/ml,最好为0.25mg/ml到大约0.5mg/ml。

在本发明的另一实施例中,凝集素为一种化学复合物,例如外源凝集素。外 源凝集素是可以粘着细胞的蛋白或者糖蛋白,包括例如刀豆球蛋白A、小麦胚芽凝 集素、Glysine max和Phaseolus vulgaris的凝集素、红豆因、大豆凝集素等,这些 凝集素如在Goldstein等人(1980)Nature 285:66和Schnebli,H.P.及Bachi,J.(1975) “外源凝集素和人红细胞的反应”(Reactions of Lectins with human erythrocytes) Exot.Cell.Research 91中所述可单独或者是组合使用。这些凝集素都可以在市场上 买到。

太阳城集团本发明的共轭物垫(13)是由疏水性材料组成的,例如玻璃纤维(Pall Specialty Material),并包含了可与样本中的分析物发生反应、或与在捕获带使捕获的分析物 发生反应的共轭物或者可检测试剂。可检测试剂包括例如特别针对分析物的抗体或 者抗原,它们与诸如有色物质、荧光物质、或化学发光物质的可检测物质共轭。胶 体金就是有色物质的一个例子。这里的共轭物垫的尺寸适于所述参数范围内的的层 析条。例如,如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起使用,共轭物垫为大约5 mm×8.5mm。通常情况下,用含有海藻糖和酪蛋白的缓冲液对共轭物垫进行预封 闭。一般情况下,该缓冲液里海藻糖的含量约为大约2.5%到大约7.5%,较佳地浓 度约为大约5%。通常,缓冲液里酪蛋白的浓度约为大约0.25%到大约0.75%,较 佳地浓度约为大约0.5%。更佳地,共轭物溶液含5%的海藻糖和0.5%的酪蛋白的 溶液。通常情况下,涂在垫上的共轭物为海藻糖浓度为2.5%,酪蛋白的浓度为0.25% 的溶液。海藻糖的目的是为了当共轭物在共轭物垫上变干时起稳定共轭物的作用, 而不是阻止其与共轭物垫或者硝化纤维膜结合。通常情况下是用一种封闭蛋白来阻 止结合。一种合适的封闭蛋白是浓度为0.5%的碱溶性的Hammarsten酪蛋白。可用 合成聚合物粘合剂加工过的玻璃纤维膜达到阻止结合的目的。当共轭物在共轭物垫 上变干时可稳定共轭物的其他试剂是众所周知的,并且本发明并不局限于使用用海 藻糖和酪蛋白预封闭过的共轭物垫。

太阳城集团本发明的缓冲液垫(14)是亲水性膜或者是人工合成膜,例如Cytosep膜 (Ahlstrom Filtration,Inc)。在图2所例示的实施例中,缓冲液垫(14)可在测试盒 (1)中进入,以在窗口2(3)上添加试剂。这里的缓冲液垫(14)的大小在所述 参数范围内与层析条相适应。例如,如果与美国专利No.6,136,610中的装置一起 使用时,缓冲液垫为大约5mm×13mm。

太阳城集团本发明的吸收垫(15,16)是一种可吸收液体的吸水性膜,例如纤维素 (Whatman,Kent,UK)或者纤维素-玻璃纤维合成物(Whatman,Kent,UK)。这里的 吸收垫的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如,如果与美国专利No. 6,136,610中的装置一起使用时,缓冲液垫为大约5mm×27mm。

太阳城集团本发明的衬垫(17)可以是由任何可以起到支撑层析条作用的惰性材料制成 的,例如塑料材质(G&L Precosion cutting,San Jose,CA)。衬垫(17)的大小在所 述参数范围内与层析条相适应。例如,如果与美国专利No.6,136,610中的装置一 起使用时,缓冲液垫的尺寸为大约5mm×60mm。

本发明的液体收集器(19)为疏水性膜,就像共轭物垫(13)的疏水性膜一 样。但是与共轭物垫(13)不同的是,液体收集器(19)不含任何可检测试剂。液 体收集器(19)的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如,如果与美国专利 No.6,136,610中的装置一起使用时,缓冲液垫的尺寸为大约5mm×13mm。

或者,如果第一样本过滤器(12)被样本垫所取代,则该样本垫在本发明中 为如Cytosep膜(Ahlstrom Filtration,Inc)这样的亲水性膜,诸如图3所示,样 本垫可用来添加试剂的,诸如向图1的测试盒(1)的窗口1(2)添加缓冲液。在向 样本过滤器(18)添加样本之前,样本垫可用来添加缓冲液来预湿层析条(9)。样 本垫的大小在所述参数范围内与层析条相适应。例如,如果与美国专利No. 6,136,610中的装置一起使用时,样本垫的尺寸为大约5mm×18mm。可任选地, 样本垫可以用抗红细胞抗体或者其他凝集素进行预处理,但如果缓冲液要施加到窗 口(2)就没有必要进行预处理。

在如图4所例示的本发明的另一实施例中,当用样本垫来取代第一样本过滤 器(12)时,样本垫可以像样本过滤器(18)的疏水性膜一样也是疏水性膜。在该 实施例中,样本垫中也可含有凝集素。或者,样本垫也可如上所述是亲水性的,可 含有也可不含有凝集素。

太阳城集团参看图5,图5示出了本发明的测试带的平面俯视图与可一起使用的测试盒之 间的对应性。在该实施例中,可检测试剂可被结合在层析条的第二端(11)、或者 可呈现在共轭物垫(13)上。当该测试带配置被用于夹心测定中时,要测定的样本 可添加到窗口1(2)和窗口2(3)。或者,可向窗口2(3)添加样本,而可向窗 口1(2)添加诸如缓冲液的试剂而不是样本。当本测试带结构被用于间接测定中 时,可向窗口1(2)添加样本,而向窗口2(3)添加缓冲液。

尽管本发明提供了可有效地从样本的液体中把红细胞分离出来,而且对细胞 容积没有依赖性的优点,但是当样本中不存在细胞或者不存在红细胞时,本发明也 可以用作对样本中的一种或者多种分析物进行检测和定量测定。因此,要测试的样 本包括血清、血浆和全血。

太阳城集团图8一般性地示出了根据本发明的测试带的另一实施例。一般而言,图8是 在图3中示出的测试带的一个变体,但在该变体中样本,至少是那些被加在共轭物 垫上(通常通过窗口2加入)的样本,在接触到样本过滤器之前与共轭物反应。在 该实施例中,层析条(9’)有第一端(10’)和第二端(11’)、样本过滤器(18’)、液 体收集器(19’)以及共轭物垫,都置于层析条(9’)的第二端(11’)。同时还有第 一样本过滤器(12’)、至少一个吸收垫(15’)、以及可任选的与第一个吸收垫(15’) 毛细接触的第二吸收垫(16’),都置于层析条(9’)的第一端(10’)。另外,可能 还会可任选地使用第三吸收垫。图8的测试条与图3中一样具有捕获带和对照带(未 示出)。样品可加到共轭物垫(13)、也可加到第一样本过滤器(12)。样本过滤器 (18’)和液体收集器(19’)都可以由同样的大孔径的材料组成,但不是必须的。 样本过滤器(18’)最好与共轭物垫(13’)的孔径大小一样,而液体收集器(19’) 的孔径则较小一些。因此,由于与层析条(9’)的接触,毛细梯度就这样形成了, (19’)>(18’)>(13’)。当如图8的装置被用于执行双向测定时,可向共轭物 垫(13’)和第一个样本过滤器(12’)加样。通常情况下,通过窗口1(2)向第一个过 滤器(12’)加样,并通过窗口2(3)向共轭物垫(13’)加样。

太阳城集团图9一般性地示出了根据本发明的测试带的另一实施例。一般而言,图9是 在图4中示出的根据本发明的测试带的一个变体。在该变体中样本,至少是如以上 图8所示的通常通过窗口2加在共轭物垫上的样本,在接触到样本过滤器之前与共 轭物反应。图9的测试带也与图4的一样具有捕获带和对照带(未示出)。图9中 的测试带的结构和图8的相类似,区别在于,样本垫(12’)与层析条(9’)直接 接触,而且比吸收垫(15’)和(16’)更远离层析条(9’)的第一端(10’)。相比之下, 在图8的测试带中,吸收垫(15’)和(16’)被堆叠在样本垫(12’)的上面,从而样 本垫(12’)的表面部分地被吸收垫(15’)和(16’)所覆盖。另外,还可任选地使用 第三吸收垫。可向共轭物垫(13’)加样,也可向第一样本过滤器(12’)加样。第一样本 过滤器(18’)和液体收集器(19’)可由同样的大孔径材料组成,但不是必须的。 样本过滤器(18’)最好与共轭物垫(13’)的孔径大小相同,而液体收集器(19’) 的孔径则较小一些。因此,由于与层析条(9’)的接触,毛细梯度就这样形成了, (19’)>(18’)>(13’)。当图9的设置用于进行双向测定时,样品可加在共轭 物垫(13’)上,也可加在第一样本过滤器(12’)上。通常情况下,通过窗口1向第一个 过滤器(12’)加样,并通过窗口2(3)向共轭物垫(13’)加样。

图10一般性地示出了根据本发明的测试条的另一实施例。一般而言,图10 是图3所示的根据本发明的测试带的一个变体。在该变体中,在层析条的第二端上 依次叠加液体收集器、样本过滤器、共轭物垫。通常情况下,液体收集器和样本过 滤器排成一条直线,而共轭物垫则偏置成它部分地与样本过滤器交迭。在该实施例 中,层析条(9”)有第一端(10”)和第二端(11”)、样本过滤器(18”)、可任选地还 有液体收集器(19”)和共轭物垫(13”),都置于层析条(9”)的第二端(11”); 同时还有一个缓冲液垫(12”),和至少一个吸收垫(15”),可任选地还有与第一吸 收垫有毛细接触的第二吸收垫(16”),都置于层析条(9”)的第一端(10”)。另外, 可任选地还使用第三吸收垫。图9的测试带还包含捕获带和对照带(未示出)。可 向样本过滤器(18”)加样本。样本过滤器(18”)和液体收集器(19”)可以由同 样的大孔径材料组成,但不是必须的。样本过滤器(18”)最好比共轭物垫(13”) 的孔径小一些,而液体收集器(19”)的孔径则比样本过滤器(18”)小一些。因此, 由于与层析条(9”)的接触,毛细梯度就这样形成了,(11”)>(18”,19”)>(13”)。 在操作中,遵从以下的顺序;(1)可任选地由缓冲液垫(12”)在第一端预湿层析 条(9”);(2)向样本过滤垫(18”)加样本,允许液体流向可任选的液体收集器(19”) 上或者直接在流向第二端(11”)的方向上流向层析条(9”),途经捕获带和对照带, 并且允许分析物在捕获带上被捕获(如果存在);(3)向共轭物垫(13”)添加缓冲 液以释放共轭物,允许共轭物流过样本过滤器(18”),流向第二端(11”),流过捕 获带和对照带,允许固定了的可检测试剂检测到在捕获带上捕获的分析物。

相似地,图11示出了一个与图10相似的实施例,不同之处在于,缓冲液垫 (12”)、吸收垫(15”,16”)、以及层析条(9”)的第一端(10”)之间的关系如图 4或者图9所示。图11的装置的操作和图10的基本相似。

因此,根据本发明的测试带的另一实施例通常是用于侧向流测定的测试带, 以便于检测样本中的至少一种分析物,该测试带包括:

(1)层析条,包括第一端和第二端,以及至少一个捕获带和至少一条对照带。 捕获带包括用于捕获至少一种分析物的固定捕获试剂,而对照带包括用于测定非特 异结合的固定对照试剂;

(2)共轭物垫,其中该共轭物垫与层析条的第二端有毛细接触,并且其中共 轭物垫包括可结合到至少一种分析物上,或者在捕获分析物之后结合到捕获试剂的 一种可流动的可检测试剂;

(3)样本过滤器,该样本过滤器在更靠近第二端处与共轭物垫相邻,其中样 本过滤器可任选地包括凝集素,并且与层析条有毛细接触;

(4)可任选地,液体收集器,置于样本过滤器和层析条之间(如果存在);

太阳城集团(5)可任选地,缓冲液垫,置于层析条的第一端,并与层析条有毛细接触;

(6)第一吸收垫,置于层析条的第一端并与之有直接或者间接的毛细接触; 以及

(7)可任选地,第二吸收垫,并与第一吸收垫有毛细接触(如果存在);其 中测试带允许对含全细胞的样本中的分析物进行检测和定量测定。

使用本发明的测试带进行侧向流试验可参照图6进行说明。图6示出了本发 明一实施例的平面俯视图,显示了在试验中样本和试剂的双向侧向流,如图2的实 施例所示。在这种实施例中,向样本过滤器(12)加样本。液体从样本过滤器(12) 流向层析条(9)的第一端(10),并在第一侧流方向(21)流向层析条(9)的第二端(11), 途经捕获带(5)和对照带(6,7)。在对照带(7)和共轭物垫(13)之间,来自样 本的液体在第一流动方向上停止流动;如果有过量的液体,则在第二次加样到窗口 2(3)后,第一次流动时的过量液体将回流、并在第二流动方向上流向层析条(9) 的第一端(10)。样本中的分析物(如果存在)将主要在液体在第一流动方向(21) 流动的过程中在捕获带(5)上被捕获,其次则在液体在第二流动方向(22)流动 的过程中被捕获。双向侧向流有利于预湿层析条,从而在带标记的试剂流入该区域 之前,层析条表面的化学物质可以溶解并均匀地分布;双向侧向流同样有利于冲洗 走捕获和对照带上的杂质,从而减少试验中的背景噪声。一种试剂,比如适合于试 验的缓冲液或者共轭物释放缓冲液,可由窗口(2)添加到缓冲液垫(14)上,缓冲 液的用量应足以溶解或者是释放共轭物。合适的共轭物释放缓冲液为1X PBS,含 有0.1%的土温20(TWEEN20),0.01%的酪蛋白,0.3%的SDS,0.2mM EDTA以 及0.1%的叠氮化钠。所释放的共轭物在第二流动方向(22)从层析条(9)的第二 端(11)向层析条(9)的第一端(10)流动,并在捕获带(5)上与分析物发生反 应。共轭物被制成相太阳城集团分析物。例如,为了检测人类血样中的人类抗体时,共轭 物可以是抗人IgG(或在人类IgM检测时是IgM),诸如但不限于,共轭于胶体金 的羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG。

在进行双向侧向流的试验中样本过滤器(12)中没有凝集素时,存在于样本 中的红细胞将有可能泄漏到层析条(9)上,从而产生高背景噪声,因此导致降低 了信噪比。发明人发现,如果共轭物释放缓冲液中含有较高浓度(如0.1%)的某 种清洁剂,诸如非离子清洁剂,比如TWEEN2O,则将能大大减小背景问题。清洁 剂与共轭物释放缓冲液的混合将有利于从捕获和对照带上冲洗走红细胞或者溶血 的红细胞,从而降低分析物和样本过滤器的非特异性结合。

如果样本过滤器(12)中使用诸如抗红细胞抗体的凝集素,以去除样本中的 红细胞,则样本过滤器(12)用诸如非离子清洁剂的清洁剂,例如土温20 (TWEEN20),进行预处理。较低浓度的例如约0.002%的清洁剂被用于此目的。 非离子清洁剂的添加有利于使样本过滤器的疏水性表面变得具有微弱亲水性,从而 凝集素就可更充分地与样本过滤器结合。

图7示出了如图4所示的本发明一实施例进行夹心法试验。比如含红细胞样 本的试样在层析条(9)的第一端(10)上被添加到第一样本过滤器(12)。来自这份试 样的液体在第一流动方向(21)上从层析条(9)的第一端(10)流向第二端(11), 流经捕获带(5)和对照带(6,7)。分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获。 然后向层析条(9)的第二端(11)的窗口2(3)将同一样本的第二试样添加到第 二样本过滤器(18)上。第二样本过滤器(18)中的液体流经液体收集器(未示出) 和共轭物垫(13)到达层析条(9)的第二端(11),然后再在第二流动方向(22) 上从层析条(9)的第二端(11)流向第一端,流经捕获带(5)和对照带(6,7)。 分析物(如果存在)将在捕获带(5)上被捕获,并且分析物与捕获带上的检测试 剂一起形成夹心。

或者,可略去样本向层析条(9)的第一端(10)上的样本垫的初始添加,而 在层析条(9)的第二端(11)上直接将样本添加到窗口2(3)的第二样本过滤器 (18)。样本过滤器(18)中的液体流经液体收集器(未示出)和共轭物垫(13)到 达层析条(9)的第二端(11);然后在第二流动方向从层析条(9)的第二端(11) 流向第一端,流经捕获带(5)和对照带(6,7)。分析物(如果存在)将在捕获带 (5)上被捕获,并且分析物将与捕获带上的检测试剂一起形成夹心。通常,在这 种操作模式中,要向第一样本过滤器(12)添加缓冲液,从而缓冲液也就可在第一 流动方向上从测试带的第一端流向第二端以预湿该测试带。

用图3所示的装置可进行类似顺序的操作。

如上所述,可使用根据本发明的测试带在单一的测定中检测多种分析物。例 如,样本可含有两种分析物,而层析条可由两条独立的捕获带组成,每条捕获带上 包含有一种固定的捕获试剂,分别针对捕获特定的一种分析物而不是另一种。或者, 样本可含有三种分析物,而层析条可由三条独立的捕获带组成,每条捕获带上包含 有一种固定的捕获试剂,分别只针对捕获特定的一种分析物,而不是其他两种。本 领域技术人员可针对单次测定所要测定的分析物的组合,根据分析物的性质和捕获 试剂的特点来选择对分析物混合物合适的捕获试剂,例如抗体。

如美国专利No.6,136,610所述,在捕获带上被捕获的分析物可被量化的。然 而,其他量化方法也是可能的。根据本发明的测试带还可以用于定性或半定量的测 定。

图12-17中示出了根据本发明的具体实施例。图12-17的设备都是使用羊抗 DNP抗体和DNP-BSA抗体作为对照,并以双向侧向流模式运行。图12是能对人 类丙肝病毒(HCV)进行间接测定的一测试带实施例的详细侧视图。图13是能对 前列腺特异性抗原(PSA)进行夹心测定的一测试带实施例的详细侧视图。图14 是能对人体艾滋病病毒的抗体进行夹心测定的一测试带实施例的详细侧视图。图 15是能对人体艾滋病病毒的抗体进行间接测定的一测试带实施例的详细侧视图。 图16是能在同一样本里同时对人体艾滋病病毒的抗体和丙肝病毒的抗体进行间接 测定的一测试带实施例的详细侧视图。图17是能在同一样本里同时对乙肝表面抗 原和梅毒抗原进行夹心测定的一测试带实施例的详细侧视图。

本文中使用的组件包括吸收垫,样本过滤器,缓冲液垫,层析条以及共轭物 垫,具有由各生产厂家指定的特性,分别列在表1里。但是,可使用其它替换组件, 并且在本领域中是众所周知的。

太阳城集团合适的分析物包括但不限于:抗原、抗体、激素、药物、细胞蛋白、DNA、 心肌标记物、肿瘤或癌症标记物、自身免疫性疾病标记物、或者其它可培育抗体的 大分子。当分析物为抗原时,该抗原可以是与传染原相关联的抗原。该传染原可以 是病毒、细菌、真菌、或者蛋白感染素。当该传染原为病毒时,病毒可从以下构成 的组中选择:艾滋病病毒、甲肝、乙肝、丙肝、丁肝病毒、单纯疱疹性病毒、细胞 巨化病毒、乳突淋瘤病毒、埃博拉病毒、非典病毒、鼻病毒、疫苗病毒,但不仅限 于这些病毒。当该传染原为细菌时,该细菌可以是革兰氏(染色)阳性或者革兰氏(染 色)阴性细菌。细菌可从以下构成的组中选择:炭疽杆菌、大肠杆菌、哈比特属幽 门菌、淋病奈瑟球菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌,但并不仅限于这些细菌。当该传染 原为真菌时,该真菌可以是霉菌或者曲霉菌,但不仅限于这些菌类。

太阳城集团当分析物为激素时,通常情况下可从以下构成的组中选择:人绒毛膜促性腺 激素、甲状腺素、促甲状腺激素、胰高血糖素、胰岛素、耻骨松弛激素、泌乳刺 激素、黄体素、促黑细胞激素、生长激素、促卵泡激素、胃泌激素、缓激肽、抗利 尿激素或其他释放因素;然而,其他一些生理学或者病理学上的感兴趣的激素都可 作为分析物。

太阳城集团当分析物为癌症或者肿瘤标记物时,它一般从以下构成的组中选择:前列腺 特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)和胎蛋白。然而,其他的癌症或者肿瘤标记物 也可以作为分析物。

当分析物为心肌标记物时,该心肌标记物一般从以下构成的组中选择:肌钙 蛋白-I、肌钙蛋白-T、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌血球素、c反应蛋白(CRP)、 脂肪酸结合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶BB型同功酶(GPBB)、B型钠尿肽(BNP)、 前脑排钠利尿胜肽(pro-BNP)。然而,分析物还可以是其他心肌标记物。

太阳城集团根据本发明的测试带和方法还可测定其他一些分析物。例如,可测定组织特 异性细胞表面标记物。通过使用以下物质,可基于标记物来分离细胞群:外源凝集 素(Reisner和Sharon,Trends in Biochem Sci(TIBS)29,1980)、白血球表面糖蛋 白(Gahmberg和Anderssen,NYAS(1978)312,Fibroblast Surface Proteins eds. Vahery,Ruslahti和Mosher)、雌激素类固醇受体(Thompson,癌症治疗报告,(1978) 63(2)180)、红血球胰岛素受体(Bhathena等人,Horm Metab Res(1981)13:179)、 或者淋巴细胞情形中的多种标记物。在T淋巴细胞的情形中,还有可能基于用特 定细胞功能标识的标记物进一步分离亚群(Reinberg和Schlossman,N Eng J med (1980)303:1153)。

类似地,也可测定共用组织的细胞表面标记物。一些细胞表面标记物存在于 多个细胞类型里。其一个示例为:主要组织相容性复合物人淋巴细胞抗原(HLA) 系统、LETS蛋白、P糖蛋白(Kartner等人,Science(1983)221:1285)和铁传递 蛋白受体(Omary等人,Nature(London)(1980)286:888)。

其他分析物包括与病毒相关联的细胞表面标记物。细胞膜表面抗原也可因感 染了病毒而产生。通过放射免疫测定(RIA)、免疫荧光法检测、红血球凝集抑制 可检测到的腮腺炎H-N糖蛋白代表了被感染细胞上的病毒标记物(Sever等人, Infect & Immun(1982)35(1):179)。类似地,因单纯疱疹病毒1型和2型的感染而 产生的标记物也可通过免疫荧光法在宿主细胞的表面上识别出来(Stewart和 Herrmann,临床免疫手册中的“Herpes Simplex Virus”(单纯疱疹病毒)一文,第 二版,编者为N.R.Rose和H.Friedman,美国微生物学会,华盛顿,1980年出版)。

还有些分析物包括肿瘤特异性细胞表面标记物。致瘤性转化和致癌性转化导 致了如在细胞表面蛋白质中所表达的细胞表型的改变。这些可观察到以下几种变 化:在细胞表面正常表达的细胞表面抗原的出现、“改变了的自体抗原”的出现、 胚胎细胞表面抗原的出现、以及肿瘤特异性分子的出现等等。Felsted等人(Canc Res(1983)43:2754)描述了在白血病早幼粒细胞的分化过程中细胞膜的变化。Poste 的评论(Cancer Invasion and Metastasis:Biologic Mechanisms and Therapy,由S.B. Day等人编辑,Raven Press 1977年在纽约出版)中综述了细胞表型中因致瘤性转 化引起的改变。类似的评论文章描述了以下的表型:白血病细胞(Greaves等人: Proc of International Symposium on Human Lymphocyte Differentiation:Its Application to Cancer,Seron和Rosenfeld编辑,North Holland Publishing 1978年在 阿姆斯特丹出版)、B淋巴细胞(Thorsky等人,出处同上)、急性淋巴细胞性白 血病细胞(Greaves等人,Science 234,1986)。鉴定肿瘤特异性抗原或标志物、 以及它们与特定组织肿瘤之间的关联可允许更清晰的诊断和随后在治疗中的监视。 许多肿瘤表面蛋白质已被鉴定。若干示例包括:突变了的大白鼠p21肿瘤淋巴细胞 蛋白(Bos等人,Nature(伦敦)(1985)315:726,和Clark等人PNAS(美国)(1985 82:5280);急性淋巴细胞性白血病相关联的GP 100 Ph1抗原(Greaves等人,Blood (1983)61:628);人T细胞白血病相关联抗原(HTLA)(Seon等人,J of Immunol (1981)127(6):2580);人肺肿瘤相关联抗原(Braatz等人,J Nat Cancer Inst (1978)61(4):1035)、雌激素24,000分子量人乳房癌标志物(Adams等人, Cancer Res(1983)43:4297);人平滑肌肉瘤抗原(Deng等人,Lancet,1981 年2月21日,403页);以及人乳腺癌抗原(Schlom等人,PNAS(1980)77(11): 6841)。进一步太阳城集团肿瘤标志物,由Edelman提出的“改变了的自体抗原”概念 (Science(1976)197:218)描述了正常情况下为某一细胞类型固有的细胞表面 抗原因致瘤性转化而发生了变化。免疫监督系统将这些异常细胞视为不正常,并且 它们能产生免疫响应(Burnet,Brit Med J(1957)1:179,Nature(1970)226: 123)。细胞的致瘤性转化后还观察到胚胎细胞抗原的重新出现。致癌胚胎细胞抗 原(CEA)、胎儿胚胎抗原(FEA)和肿瘤特异性移植抗原(TSTA)都在癌瘤和 肉瘤的血液检测中起了作用(Mitchison,“Immune Surveillance”in B and T Cells in Immune Recognition(在免疫识别中B和T细胞的“免疫监督”),F.Loors和G. E.Roelants编辑,Wiley and Sons 1977年在纽约出版)。

其他分析物包括脂蛋白、酶、免疫球蛋白、淋巴因子、细胞活素和药物,包 括在半抗原化的过程中可针对其来制备抗体的任何药物。在半抗原化过程中,在注 射进可产生抗体的动物体内时因太小而不能产生抗体的分子可耦合到诸如蛋白质 分子的较大的载体分子,比如钥孔虫戚血蓝素,再以这种形式注入以产生抗体。

其他蛋白质分析物包括皮质(激)素传递蛋白、红细胞沉淀素、铁传递蛋白、各 种球蛋白、甲状腺激素结合球蛋白、A,B,C,D,E,M等各型的免疫球蛋白, 各种补体因子、例如纤维蛋白原的血栓因子、第八因子、组织凝血激酶和凝血酶。

其他分析物还包括药物,既包括治疗药物或者滥用和可能被滥用的药物。在 授予Ullman等人的美国专利3,996,345中公开的很多药物可被视为分析物,此专利 通过引用结合在此。这些药物包括但不限于,生物碱、生物碱的代谢物(包括吗啡、 可卡因、酶斯卡灵、麦角酸)、以及合成鸦片。还有其它药物包括,美沙酮、杜冷 丁、安非他明、脱氧麻黄碱、苯乙哌啶酮、苯妥英和所有属于苯并二氮杂环庚烷 (benzdiazocycloheptane)、吩噻嗪、巴比妥酸盐类别的药物。其他药物包括肾上腺 素、麻黄素、左旋多巴和降肾上腺素。其他药物还包括安定药氨甲丙二酯、Tergitol、 例如Ethoxsumide的琥珀酰亚胺。其他药物还包括四氢大麻酚、大麻醇和相关的衍 生物,主要为由大麻、其合成修饰物和代谢物衍生的复合物。其他药物还包括类固 醇的药物,例如雌激素、助孕素、男性激素、肾上腺皮质激素、胆酸、强心苷、糖 苷配基、皂角苷、皂角苷配基。通常情况下,如以上提到的,为了产生抗体,需要 对例如类固醇、类固醇、缩氨酸等的一些小分子半抗原化。

太阳城集团尽管上面的讨论集中在可根据抗原抗体反应确定为分析物的物质,但术语“分 析物”并不视为将用根据本发明的设备和方法来测定的物质的范围限制于只能根据 抗原抗体反应来测定的物质。例如,如果存在可与分析物结合的特异性很好的特异 性结合蛋白,则可用该合适的特异性结合蛋白来取代固定在层析条上的抗体、或者 是用共轭物标记的抗体。这些特异性结合蛋白包括但不限于:作为用来测定维他命 B12的一对特异结合蛋白中的一员的内在因子蛋白;用来检测叶酸的叶酸结合蛋白、 作为用来测定碳水化合物的一对特异性蛋白中的一员的血凝素;或用来检测相对应 的细胞分裂素、淋巴激活素、生长因子的细胞分裂素受体、淋巴激活素受体、生长 因子受体(例如Interleukin-1受体)。

另外,术语“分析物”还包括核酸,例如DNA或者RNA,只要有适合它们 的特异性结合大分子即可。这些合适的特异性结合大分子可以是以序列特异性方式 与核酸结合的蛋白,也可以是按照Waston-Crick碱基配对理论与要检测的序列结合 的核酸分子或者是核酸分子的相似物。如果要检测的核酸有足够的长度,那么要检 测的核酸可与固定的互补核酸在核酸分子内的一段序列上杂交,然后可在核酸分子 内的另一段序列上与带标记的核酸再进行杂交。该过程一般被称为“夹心法杂交”, 并在授予Manoharan等人的美国专利No.6,825,331中有更详细的描述,此专利通 过引用结合于此。

当在进行双向测定时向窗口1加样本,并且向窗口2加缓冲液以在第二方向 上流动时,合适的缓冲液与添加到样本里的样本或任何试剂在pH值和离子强度方 面相兼容。缓冲液不能与样本中的任何分析物或大分子发生反应。合适的缓冲液包 括但不限于:磷酸盐缓冲液、林格液(Ringer’s solution)、汉克液(Hank’s solution) 或者(tris)hydroxymethylaminomethane(TrisTM)缓冲液。在向窗口1加缓冲液时可 使用同一类型的缓冲液来预湿层析条,并向窗口2加样本。

表1:窗口2中膜的选择的一览表     上层     化学特性   疏水性/     亲水性   孔径     (微米)   流速     (毫升/分钟)   毛细引力     (毫米/分钟)     下层   是否能   过滤     红细胞   #111   纤维素   亲水   1   130   51   共轭物垫   不能   #141   玻璃纤维   疏水   3   350   79   共轭物垫   不能   #142   玻璃纤维   疏水   6   300   55   #142   不能   #142   玻璃纤维   疏水   6   300   55   共轭物垫   可以     #1660   合成纤维     (CytoSep)     亲水     3     100     52     共轭物垫     不能     #1661   合成纤维     (CytoSep)     亲水     5     260     41     共轭物垫     不能     #1662   合成纤维     (CytoSep)     亲水     3     35     46     共轭物垫     不能     #1663   合成纤维     (CytoSep)     亲水     2     35     46     共轭物垫     不能     #319   合成纤维     (CytoSep)     亲水     19     375     54     共轭物垫     不能   共轭物垫   玻璃纤维   疏水   42   250   46   共轭物垫   不能

工业实用性

本发明可有利地应用于包括床边检测(POC)设备的诊断设备方面,例如医 生办公室、诊所或者是战场,用来测定样本中包含或者不包含细胞(比如红细胞、 白细胞或者其他细胞类型)的分析物的存在和量。本发明的材料和方法在检测一些 疾病因子或者抗体中有用途,包括HIV、HAV、HBV、HSV、CMV、SARS、疫苗 病毒和其他一些分子,包括例如deoxypyrodinoline(一种骨骼吸收标记物)、人血 清蛋白、乱用药物、违禁药物、蛋白标记物(例如前列腺特异性抗原(PSA)、例 如L-乳酸脱氢酶的肾脏疾病蛋白、例如人体绒(毛)膜促性腺激素(HCG)的怀孕或 者生育能力相关的激素、以及尿道感染标记物。血液携带的分析物的测定特别适于 本发明,例如治疗药物、激素、诸如前列腺特异性抗原(PSA)的癌症标记物、心 肌标记物(包括肌钙蛋白-I、肌钙蛋白-T、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、α胎蛋白)。 另外,样本可以是全血样本。因此,虽然本发明的设备和方法适于测定各种体液, 包括尿液、唾液、汗液或者其他黏液,但它特别适于测定那些含有红细胞的测试液 和测定只有很少量的样本,例如采自手指的血。

示例

太阳城集团旨在仅仅例示本发明,因此不应视为以任何方式来限制本发明的示例说明和 详述了本发明的上述详细方面和实施例。这些示例并不代表以下试验是所有或者唯 一操作过的试验。我们已经努力保证试验数据的准确性(例如:数量、大小等等), 但是应该考虑到一些试验的误差和偏差。

太阳城集团尽管已参照具体实施例描述了本发明,但那些本领域技术人员应该明白:在 不背离本发明的真实精神和范围的情况下,可进行各种各样的改动并可替代等效方 案。另外,可进行许多修改以使具体情况、原料、实物组成、过程、过程步骤适于 本发明的目的、精神或范围。但所有这些修改旨在处于本发明权利要求的范围之内。

太阳城集团为了找到最好的材料和条件以进行对包含细胞的样本(比如含有红细胞的全 血样本)中的分析物作出测定或定量的侧向流测定,包括确定用来过滤样本中细胞 或液体(例如血浆)的膜和膜的组合,使用在美国专利NO.6,136,610和美国专利 No.6,528,323中描述的和并如在本文中做了改进的仪器(“ReLIA”)和检测盒进行 以下实验。

太阳城集团示例一:在没有凝集素的情况下膜的过滤性能

如图2所示的测试带采用不同膜作为样本过滤器。所有测试的过滤膜都从美 国Ahlstrom Filtration公司购买并包括:111级纤维素吸收剂,#141级和#142级玻 璃纤维,1660、1661、1662和1663级Cytosep。如图1所示,含全血的样本被加 到窗口1。血浆在硝基纤维素层析条上的流动速度可被观察记录。结果如表2所列。

表2:没有人红细胞抗体的滤血膜     膜     样本   加样量     (微升)   红细胞     泄漏   迁移速度     (毫米/分钟)     背景   红细胞在NC上出现     的太阳城集团(分钟)   Grade 111   纤维   全血   100   有   ≤16   红   8   100   有   ≤16   红   8   100   有   ≤16   红   8   100   有   ≤16   红   8   100   有   ≤16   红   8   Grade 141   玻璃纤维   全血   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   Grade 142   玻璃纤维   全血   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   Grade 1660   Cytosep   全血   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   100   有   ≤16   红   2   Grade 1661   Cytosep   全血   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   100   有   ≤16   红   3   Grade 1662   Cytosep   全血   100   有   ≤16   红   4   100   有   ≤16   红   4   100   有   ≤16   红   4   100   有   ≤16   红   4   100   有   ≤16   红   4   Grade 1663   Cytosep   全血   100   有   <16   红   10(粘性)   100   有   <16   红   10(粘性)   100   有   <16   红   10(粘性)   100   有   <16   红   10(粘性)   100   有   <16   红   10(粘性)

太阳城集团例二:用抗-人红细胞抗体预处理后的膜的滤血能力

将1克土温20(TWEEN20)加到9ml的去离子水中,将溶液混匀,在室温下存 储大概一周,可配制成10%的土温20(TWEEN20)溶液。

太阳城集团在1.35升的去离子水里加入9.0825克的三(羟甲基)氨基甲烷(Trizma Base) (最终浓度为6.055克/升),1.7625ml的HCL(最终浓度为1.7625毫升/升)以及1.8 克的乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na2)(最终浓度为1.2克/升),可配制成兔抗人红 细胞抗体溶液。缓慢地搅拌混合物大约一个小时直到所有加入的化学试剂都完全溶 解。配制好的溶液放在室温下储存4个小时,或者在4℃下过夜。向溶液里添加盐 酸将溶液pH值调节到pH8.5±0.1。在溶液里加兔抗人红细胞抗体(anti-hRBC) 直到最终浓度为大约0.25毫克/毫升。将0.3毫升的10%浓度的土温20(TWEEN20) 加入到anti-hRBC直到最终浓度为0.002%。将最终配制好的溶液在4℃存放24小 时。用anti-hRBC处理每种可能用作样本过滤器的不同膜,并以图2所示的配置来 测试它们过滤加到窗口1的新鲜的人全血样本的能力。结果记录在表3中。

太阳城集团表3:经抗人红细胞抗体预处理后的滤血膜     膜   抗人红细胞抗体     (毫克/毫升)     样本   加样量     (微升)   红细胞     泄漏   迁移速度     (毫米/分钟)     背景   红细胞在NC上     出现的太阳城集团   Grade   111   0.25   全血   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   Grade   141   0.25   全血   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   Grade   142   0.25   全血   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   Grade   1660   0.25   全血   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   Grade   1661   0.25   全血   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后

  Grade   1662   0.25   全血   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   100   无   ≤16   干净   1小时后   Grade   1663   0.25   全血   100   ---   ---   无过滤   ---   100   ---   ---   无过滤   ---   100   ---   ---   无过滤   ---   100   ---   ---   无过滤   ---   100   ---   ---   无过滤   ---

太阳城集团表三(继续)   膜   抗人红   细胞抗体   样本   红细胞   泄漏   检测太阳城集团   (分钟)   HC   Dr   LC   Dr   TEST   Dr   RI=Test   Dr/LC     Dr     S/CO   红细胞     泄漏太阳城集团   #142   无   HIV   阳性   全血     50微   升   有   30   ---   ---   ---   ---   2分钟   无   有   30   ---   ---   ---   ---   2分钟   无   有   30   ---   ---   ---   ---   2分钟   无   有   30   ---   ---   ---   ---   2分钟   无   有   30   ---   ---   ---   ---   2分钟   缓冲     液垫   有   一些   30   ---   ---   ---   ---   3分钟   有   一些   30   ---   ---   ---   ---   3分钟   有   一些   30     ---     ---     ---     ---   3分钟   有   一些   30   ---   ---   ---   ---   3分钟   有   一些   30   ---   ---   ---   ---   3分钟   #142   有   无   30   0.2713   0.2116   0.182   0.8601   8.603   1小时后   有   无   30   0.1422   0.1715   0.1761   1.0268   10.2693   1小时后   有   无   30   0.1981   0.1921   0.2282   1.1879   11.8776   1小时后   有   无   30   0.2037   0.1843   0.1899   1.0304   10.3033   1小时后   有   无   30   0.2287   0.1899   0.1846   0.9721   9.723   1小时后

实验结果显示:不同的膜在结合诸如anti-hRBC抗体的凝集素一起使用时,可 用来过滤红细胞,并且50μl的样本量足以检测。

太阳城集团示例三:使用全血和使用血浆之间的对比

太阳城集团准备如示例二的测试带,并将全血或血浆样本加入窗口1的样本过滤器,且 比较结果,如表4所示。

太阳城集团表4  全血和血浆的测试结果的比较     膜   抗人红血胞   抗体   (毫克/毫升)     样本   加样量   (微升)   红细   胞泄   漏   检测   太阳城集团   (分钟)     HC   Dr     LC   Dr     TEST   Dr   RI=     TEST   Dr/LC Dr       S/CO       结果   #142   0.25     HIV   阴性血   50   无   30   0.1777   0.0862   0   0   0   阴性   0.25   50   无   30   0.2268   0.0967   0   0   0   阴性   0.25   50   无   30   0.073   0.1083   0   0   0   阴性   0.25   50   无   30   0.183   0.0728   0   0   0   阴性   0.25   50   无   30   0.3277   0.109   0   0   0   阴性   #142   0.25   HIV   阴性   血浆   50   无   15   0.4033   0.1926   0   0   0   阴性   0.25   50   无   15   0.3587   0.1945   0   0   0   阴性   0.25   50   无   15   0.36   0.1919   0   0   0   阴性   0.25   50   无   15   0.3822   0.1955   0   0   0   阴性   0.25   50   无   15   0.3759   0.1964   0   0   0   阴性     #142     0.25   HIV   阳性血     50     无     30     0.1213     0.1781     0.2014     1.1308   11.31     1     阳性     0.25     50     无     30     0.1419     0.1441     0.2181     1.5135   15.13     25     阳性       0.25     50     无     30     0.1781     0.1408     0.2153     1.5291   15.29     11     阳性     0.25     50     无     30     0.074     0.075     0.1032     1.3760   13.76     26     阳性     0.25     50     无     30     0.1653     0.1605     0.2142     1.3346   13.34     58     阳性       #142   0.25   HIV   阳性     血浆   50   无   15   0.2755   0.1423   0.2011   1.4132   14.13   阳性     0.25     50     无     15     0.3628     0.18     0.2344     1.3022   13.02     44     阳性     0.25     50     无     15     0.3084     0.1451     0.2005     1.3818   13.81     66     阳性     0.25     50     无     15     0.3149     0.1468     0.1862     1.2684   12.68     52     阳性     0.25     50     无     15     0.3425     0.1647     0.2164     1.3139   13.13     9     阳性

实验结果显示:无论是全血还是血浆样本都可使用本发明的测试带,两者都 可得到基本上一致的定量结果。

示例四:不同的膜作为样本过滤器用于在窗口2加样的比较

太阳城集团在这个示例中,构建了如图2所示的测试带,但是用从以下膜中选择的一种 或两种样本过滤器替换了图2的缓冲液垫:美国Ahlstrom Filtration公司的1661级 Cytosep(“1661”)、1660级Cytosep(“1660”)、#142级玻璃纤维(“142”)、#141 级玻璃纤维(“141”)、或者111级纤维素(“111”)。这些样本过滤器都已经测试过 它们过滤红细胞的能力。同样还使用了Millpore公司生产的共轭物垫以及硝基纤 维素膜,如图2所示。向窗口2加入一定量的血液样本。表5上示出的结果显示: Cytosep 1661、#141级玻璃纤维、#142级玻璃纤维都能过滤样本,以允许血浆渗透 到硝基纤维素膜上,同时发现#141级玻璃纤维、#142级玻璃纤维所需的过滤太阳城集团 最短。

太阳城集团表5  不同膜单独用作样本过滤器的比较     膜的型号   加样量     (微升)   血浆滤出太阳城集团     (秒)   红细胞泄漏     太阳城集团(秒)   血浆迁移速率     (毫米/分钟)   30分后残留在过滤     器上的红细胞   1661   200   240   290   1.8   有   1660   200   -   -   -   141   200   90   280   16.8   有   142   200   98   395   16.1   111   200   -   -   -   有

注:“-”是指没有血浆滤出和迁移到硝基纤维素膜。

表6  双层过滤样本的不同膜的比较     膜的型号   加样量     (微升)   血浆滤出太阳城集团     (秒)   红细胞泄漏     太阳城集团(秒)   血浆迁移速率     (毫米/分钟)   142+142   200   457   582   5.87   141+141   200   135   1015   1.95   141+142   200   113   238   2.93   142+141   200   640   686   2.26   141+1661   200   111   236   5.74   142+1660   200   247   409   3.41   142+1661   200   112   253   2.83   141+1660   200   440   582   5.71

表6中示出的结果显示:所测试的所有膜的组合都允许血浆以不同的速度从 组合的样本过滤器里滤出。

示例5:在窗口2加样时#141和#142级玻璃纤维作为样本过滤器的测试

在这个示例中,构建了如图2所示的测试带,不同之处在于图2中示出的缓 冲液垫被样本过滤器所替代,用于加样。本实验中所使用的样本过滤器是单层玻璃 纤维膜,使用之前用0.5毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体(中国安康生物生产,简称 anti-hRBC)或者鼠抗人红细胞抗体预处理(由星号*标志)的#141级或者#142级 膜。而且,共轭物垫(CP)和玻璃纤维膜一起测试。CP预先用0.5毫克/毫升的兔 抗人红细胞抗体(“anti-hRBC”)、或鼠抗人红细胞抗体预处理,或不作预处理。硝基 纤维素膜(“NC”)如前所述地使用。向窗口2加特定量的全血样本(200微升)。

太阳城集团实验结果如表7所示。

实验结果显示:所测试的所有膜,不管是单独的CP垫(共轭物垫,下同)还 是#141或者#142与CP垫的组合,无论是否用人抗红细胞预处理过或没有预处理 过,都能允许血浆滤出到NC膜(硝基纤维素,下同)上。血浆渗透到NC的太阳城集团 过程,对于#141*+CP垫*的组合为大约124秒,对于#142*+CP垫*的组合为大约 126秒,对于#141*+CP垫的组合为大约130秒,对于#142*+CP垫的组合为大约 140秒。从单一的CP垫滤出的太阳城集团为大约138秒。最好的过滤/迁移结果为#142+CP 垫的组合。

太阳城集团如果只有CP垫,则红细胞可相对比较快地从CP垫里泄漏,约需159秒,并 且在实验开始30分钟之后可很明显地在NC膜上观察到。相反,在对#142*+CP垫 组合的实验过程中,宏观上红细胞的泄漏不明显;对于这种组合,在实验开始后 30分钟的太阳城集团点,在NC膜上宏观上红细胞的泄漏不明显。相比较而言,#141*+CP 垫*的组合的效果略差,红细胞泄漏大约需要1350秒(22.5分钟),并且在30分钟 的太阳城集团点宏观上一些红细胞可在NC膜上明显观察到。

再作进一步的比较,#142*+CP垫的组合效果也较差,其中CP垫未用抗红细 胞抗体作预处理,在约1150秒(19.2分钟)红细胞开始从这些过滤器中滤出,实 验开始之后的30分钟点可在NC膜上看到一些红细胞。对于#141膜*+CP垫的组 合,在680秒(11.3分钟)上可观察到有红细胞漏出,并且可在NC膜上看到一些 红细胞。在这个实验中,血浆在所测试的所有膜上的流动速度都大于16毫米/分钟。

表7:膜的组合在过滤红细胞中的比较     膜的型号   加样量     (微升)   血浆滤出太阳城集团     (秒)   红细胞漏出太阳城集团     (秒)   血浆迁移速率     (毫米/分钟)   30分钟后NC     上显示红细胞   142*+CP   200   140   1150   >16   一些   142*+CP*   200   126   -   >16   没有   141*+CP   200   130   680   >16   一些   141*+CP*   200   124   1350   >16   少量   只有CP   200   138   159   >16   完全滤出

太阳城集团注:“*”表示用0.5毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体(鼠抗人红细胞抗体)预 处理。

太阳城集团“-”表示加血样后30分钟内无红细胞泄漏到测试窗口

太阳城集团示例1-5的实验结果表明:当把样本加到窗口2时,单层膜的孔径不是决定该 膜是不是适合作为分析物的样本过滤器的决定因素。在所测试的膜中,纤维素111 的孔径最小为1微米(见表1),并且能使红细胞不漏出(表5)。然而,如表5所示, 血浆不能从膜中滤出。CytoSep 1660膜和玻璃纤维膜#141的孔径均为3微米(见表 1),但是血浆从玻璃纤维膜#141中滤出、但却不能从CytoSep 1660膜中滤出。区 别在于,玻璃纤维膜是疏水性的,而CytoSep 1660的疏水性则较弱而亲水性较强。

太阳城集团类似地,与上面的假设一致,即孔径并不是决定某种膜是否可作为过滤器的 决定因素,玻璃纤维膜#141的孔径为3微米,小于玻璃纤维膜#142的孔径为6 微米,然而血浆从较小孔径膜#141中滤出的速度更快,即为90秒,而相比之下 对于较大孔径膜#142则为98秒(表5)。红细胞从#141膜滤出得比#142膜快,即 280秒对395秒。血浆的迁移速度对#141膜(16.8毫米/分)而言比#142(16.1毫 米/分)膜快。

使用两个样本过滤器而不是一个可减缓血浆在玻璃纤维膜中的迁移速度,从 约16毫米/分(表5)降低到约1.95毫米/分到约5.87毫米/分的范围(表6)。红细胞仍 然可从这些双层过滤器中滤出(表6)。对于#141+#141的组合,红细胞需要1015 秒(16.9分钟)滤出到NC膜上;血浆需要135秒(2.3分钟)滤出(表6)。对于#142+#141 的组合,当#142膜在#141膜之上的时候,红细胞滤出需要686秒(11.4分钟),但 是血浆滤出则需要更长的太阳城集团,为640秒(10.7分钟)(表6)。对于#141+#142膜的 组合,当#141膜在#142膜之上的时候,血浆更快地滤出,只需要113秒(1.9分钟), 红细胞滤出的速度也快得多,为238秒(约4分钟)(表6)。

当抗人红细胞anti-hRBC抗体与任一种所测试的样本过滤器膜(表3)一起使 用时,所有所测试的膜都表现出良好的过滤红细胞的能力,因为在30分种内没有 明显的红细胞泄漏。在NC膜上的背景噪声也低。血浆的迁移速度低于16毫米/ 分。对于CytoSep 1663膜,血浆过滤不明显。这样就有可能采用用抗红细抗体胞 预处理过的#142玻璃纤维膜去定量分析含有HIV抗体的血液(表3)。表3也示出: 50微升的样本大小足以从测定中获得定量结果。

#141*+CP垫的组合(表7),其中#141膜用抗红细胞抗体进行了预处理,在 滤出红细胞方面表现比单独使用没有预处理过的#141膜好(表5)。类似地, #142*+CP垫的组合在滤出红细胞方面表现比单独使用没有预处理过的#142膜好。 在这个实验里,#142*+CP垫的组合在滤出红细胞和血浆方面是最有效的。

太阳城集团示例六:血液样本中存在抗凝剂时测试血浆和红细胞过滤的效率

在本实验里玻璃纤维膜#142用做样本过滤器。如前所述,用0.25毫克/毫升的 兔抗人红细胞抗体对#142膜进行预处理。然后再用抗凝剂(1.5毫克/毫升的乙二胺 四乙酸二钠、3.5毫克/毫升的柠檬酸三钠、或者0.1毫克/毫升的肝素钠)进行预处 理该膜,或者不进行预处理也可以。血液样本在加样到样本过滤器前也同样用抗凝 剂(1.5毫克/毫升的乙二胺四乙酸二钠、3.5毫克/毫升的柠檬酸三钠、或者0.1毫克 /毫升的肝素钠)做预处理或者不进行预处理。血液样本如上所述地加到窗口2的样 本过滤器上。实验结果如表8和表9所示。

表8  #142上没有抗凝剂时过滤血浆的效率   没有抗凝剂   的#142   全血量   50微升   75微升   150微升     红细胞   漏出     血浆迁移   (毫米/分)     残留的   红细胞     红细胞   漏出     血浆迁移   (毫米/分)     残留的   红细胞     红细胞   漏出     血浆迁移   (毫米/分)     残留的   红细胞   没有抗凝剂   的血样   否   ≤16   微量   否   >16   少量   否   >16   较多   加EDTANa2  的血样   否   ≤16   微量   否   >16   少量   否   >16   较多   加柠檬酸三   钠的血样   否   ≤16   微量   否   >16   少量   否   >16   较多   加肝素钠   的血样   否   ≤16   微量   否   >16   少量   否   >16   较多

太阳城集团表9#142上有抗凝剂的过滤血浆的效率   用抗凝剂   预处理的   #142   全血量   50微升   75微升   150微升     红细胞   漏出     血浆迁移   (毫米/分)     残留的   红细胞   红细   胞漏     出     血浆迁移   (毫米/分)     残留的   红细胞     红细胞   漏出     血浆迁移   (毫米/分)     残留的   红细胞   没有抗凝   剂的血样   否   ≤16   微量   否   >16   少量   否   >16   较多   加   EDTANa2  的血样     否     ≤16     微量     否     >16     少量     否     >16     较多

太阳城集团   加柠檬酸   三钠的血   样     否     ≤16     微量     否     >16     少量     否     >16     较多   加肝素钠   的血样   否   ≤16   微量   否   >16   少量   否   >16   较多

实验结果显示:在双向流测定中,是在血液样本中还是在样本过滤器中填加 抗凝剂并不影响血浆过滤效率。

示例七定量测定中红细胞容积的影响

太阳城集团以下实验是为了确定红细胞容积对侧向停止流动测定是否有影响而进行的。 乙肝表面抗原呈阳性、所测血细胞比容为44%的全血样本被分装为每管1毫升。 把这些分装管的红细胞容积都看成是100%。同一个血液样本进行15分钟的800× g的旋压,通过取出或加入血浆后血细胞比容增加或减少40%。用0.5毫克/毫升 的鼠抗人红细胞抗体对玻璃纤维膜#142进行预处理,并将其用做乙肝表面抗原检 测盒的窗口2上的样本过滤器。向窗口2中的样本过滤器加样以进行侧向流测定。 该侧向流测定如上所述地进行。在该配置中,测试带中样本过滤器的下面设置有一 液体收集器,如图3所示,其中该液体收集器由一层类似共轭物垫的玻璃纤维膜组 成,但是却没有共轭物垫的用胶体金标记的抗原或抗体。试验结果如表10所示。

表10  红细胞容积在HBsAg定量测定中的影响   加样量     (微升)   迁移速率     (毫米/分)   HbsAg浓度     (纳克/毫升)   均值1   (纳克/     毫升)   均值2   (纳克/     毫升)     SD     CV  正常=100%   200   >16   18.7     18.475   17.36   0.72   4.1%  正常=100%   200   >16   19.4  正常=100%   200   >16   18.6  正常=100%   200   >16   17.2  测试CV   4.99%  升高10%   200   >16   16.7   16.925  升高10%   200   >16   16.5  升高10%   200   >16   19.3  升高10%   200   >16   15.2  测试CV   10.1%  升高20%   200   16   18.2   16.9  升高20%   200   16   16.7  升高20%   200   16   15.4  升高20%   200   16   17.3

  测试CV   7.0%   升高30%   200   <16   15.8   17.3   升高30%   200   15.6   升高30%   200   20.8   升高30%   200   17.1   测试CV   13.9%   下降10%   200   >16   16.8   16.15   下降10%   200   >16   16   下降10%   200   >16   16.2   下降10%   200   >16   15.6   测试CV   3.1%   下降20%   200   >16   17.3   16.98   下降20%   200   >16   18.6   下降20%   200   >16   16.1   下降20%   200   >16   15.9   测试CV   7.3%   下降30%   200   >16   16.7   17.9   下降30%   200   >16   19   下降30%   200   >16   18.2   下降30%   200   >16   17.7   测试CV   5.4%   下降40%   200   >16   18.5   17.48   下降40%   200   >16   17.6   下降40%   200   >16   16.4   下降40%   200   >16   17.4   测试CV   5.0%   血浆   200   >16   19.3   18.1   血浆   200   >16   17.6   血浆   200   >16   18.7   血浆   200   >16   16.8   结果CV   6.2%   注:SD指标准偏差  CV指变化系数

某一特定血浆容积的乙肝表面抗原浓度在4次独立测定中确定,并取其平均 值以产生均值1。将所测试的不同血浆容积的每一个中乙肝表面抗原的平均浓度再 取平均值,得到均值2。所观察到的变化系数(CV)值小于5%,表明不同红细胞 容积对测定结果几乎没有影响。

类似地,来自促甲状腺激素(TSH)异常病人的全血样本,经放射性免疫测 试时促甲状腺激素的浓度为28μlU/ml,测得血细胞比容为44%,将该全血样本分 装成每管1毫升。视这个红细胞容积为100%。同一个血液样本进行15分钟800× g的旋压,通过取出或加入血浆后来红细胞容积增加或减少40%。用0.5毫克/毫 升的鼠抗人红细胞抗体对玻璃纤维膜#142进行预处理,并将其用作促甲状腺激素 测试盒中窗口1和窗口2上的样本过滤器。按照表11所指定的量,首先向窗口1 加样,然后向窗口2加样。在这个例子里,每个样本用同批测试盒平行检测4次, 并且如图3所示,在每条测试带的样品过滤器的下方设置有液体收集器,此液体收 集器由一层类似共轭物垫的玻璃纤维膜组成,但是却没有共轭物垫的用胶体金标记 的抗原或抗体。

表11  红细胞容积在促甲状腺定量测定中的影响           样本     窗   口1   加   入   量     (微   升)     窗   口2   加   入   量     (微   升)         测试   太阳城集团   (分钟)           HC   Dr           LC   Dr           测试   Dr         RI=TEST     Dr/LC Dr           浓度     (uIU/ml)           均值-1     (uIU/ml)           均值2     (uIU/ml)             SD             CV%   正常   50   150   30   0.3679   0.4733   0.3456   0.7302   29.66   28.09   28.5758   2.1258   7.44   0.4209   0.4736   0.3368   0.7111   28.29   0.4367   0.5451   0.4117   0.7553   31.56   0.4582   0.5414   0.3797   0.7013   27.6   0.3017   0.4605   0.2929   0.6360   23.34   升高   10%   50   150   30   0.316   0.5106   0.3958   0.7752   33.13   28.858   0.3918   0.6377   0.4369   0.6851   26.49   0.3019   0.4654   0.3739   0.8034   35.49   0.3851   0.6016   0.3954   0.6572   24.66   0.3654   0.5234   0.3428   0.6549   24.52   升高   20%   50   150   30   0.2492   0.4968   0.3521   0.7087   28.12   33.096   0.1325   0.4081   0.3378   0.8277   37.64   0.4036   0.4981   0.3921   0.7872   34.12   0.2374   0.4832   0.3663   0.7581   31.77   0.3286   0.4739   0.3714   0.7837   33.83   升高   30%   50   150   30   0.285   0.5246   0.3487   0.6647   25.14   25.976   0.3095   0.5654   0.3776   0.6678   25.35   0.387   0.5638   0.3756   0.6662   25.24   0.3331   0.5218   0.3613   0.6924   26.99   0.4314   0.4937   0.3431   0.6950   27.16   降低   10%   50   150   30   0.4032   0.58   0.4178   0.7203   28.95   30.118   0.4378   0.4639   0.3431   0.7396   30.37   0.4119   0.534   0.406   0.7603   31.95   0.3408   0.5217   0.3823   0.7328   29.86   0.403   0.5726   0.4165   0.7274   29.46   降低   50   150   30   0.2859   0.4134   0.5012   1.2124   28.8   27.944

  20%   0.3542   0.3538   0.5372   1.5184   28.03   0.1217   0.4228   0.5584   1.3207   26.65   0.3955   0.3661   0.5727   1.5643   26.31   0.1942   0.3896   0.4754   1.2202   29.93   降低   30%   50   150   30   0.4156   0.531   0.3725   0.7015   27.62   28.176   0.4138   0.5416   0.3874   0.7153   28.58   0.4028   0.5107   0.3742   0.7327   29.85   0.3895   0.5227   0.3686   0.7052   27.87   0.3955   0.5437   0.3763   0.6921   26.96     降低   40%     50     150     30     0.3898     0.5024     0.3631   0.7227     29.12     28.732   0.4023   0.5343   0.412   0.7711   32.81   0.369   0.5512   0.3706   0.6724   25.64   0.3775   0.4997   0.3581   0.7166   28.68   0.4182   0.5448   0.3806   0.6986   27.41   血浆   50   150   30   0.4   0.4439   0.3034   0.6835   26.39   26.192   0.361   0.4208   0.2795   0.6642   25.12   0.3539   0.4248   0.2846   0.6700   25.49   0.4089   0.4244   0.3018   0.7111   28.29   0.3799   0.448   0.3014   0.6728   25.67   注:HC高浓度对照带光密度值      LC低浓度对照带光密度值      TD测试带光密度值   “uIU/ml”指“微国际单位/毫升”    SD指标准偏差   CV%指变化系数

太阳城集团某一特定血浆容积的促甲状腺浓度在5次独立测定中确定,并取其平均值为 均值1。将所测试的不同血浆容积的每一个的促甲状腺平均浓度再取平均值,得到 均值2。所观察到的变化系数(CV)值小于8%,表明不同红细胞容积上对TSH 测试结果几乎没有不同。

太阳城集团示例八  红细胞容积在定量测定中的影响

太阳城集团以下试验是为了验证红细胞的存在是否会影响双向侧向流测定中的定量或定 性检测的准确度而进行的。HIV阳性的全血样本分装成每管1毫升,样本的血细胞 比容为45.3%。将该红细胞容积视为100%。同一个血液样本进行15分钟800×g的 旋压,通过取出或加入血浆后红细胞容积增加或减少40%。用0.25毫克/毫升的兔 抗人红细胞抗体对玻璃纤维膜#142进行预处理,将其用作HIV测试盒中窗口1上 的样本过滤器。试验结果记录在表12中。

太阳城集团表12  红细胞容积对HIV测定的影响   红细胞     容积   检测   太阳城集团     (分钟)     HC   Dr     LC   Dr     测试   Dr   RI=   TEST   Dr/LC   Dr     S/CO     均值1     均值2     SD     CV   正常=100%   30   0.2341   0.1272   0.2059   1.6187   16.18   19.69   20.0019   1.8855   0.0943   正常=100%   30   0.2066   0.0941   0.2123   2.2561   22.57   正常=100%   30   0.2824   0.0942   0.1914   2.0318   20.32   升高10%   30   0.3702   0.1324   0.2564   1.9366   19.36   19.61   升高10%   30   0.225   0.1193   0.2241   1.8785   18.78   升高10%   30   0.0961   0.1044   0.216   2.0690   20.69   升高20%   30   0.0503   0.1144   0.1752   1.5315   15.32   17.9233   升高20%   30   0.0753   0.136   0.2474   1.8191   18.19   升高20%   30   0.0747   0.1107   0.2243   2.0262   20.26   升高30%   30   0.1036   0.1056   0.2463   2.3324   23.32   17.3633   升高30%   30   0.2257   0.1545   0.2548   1.6492   16.49   升高30%   30   0.2486   0.1975   0.2425   1.2278   12.28   降低10%   30   0.2859   0.0954   0.2555   2.6782   26.78   22.8267   降低10%   30   0.1217   0.12   0.3136   2.6133   26.13   降低10%   30   0.3955   0.1297   0.202   1.5574   15.57   降低20%   30   0.3806   0.1136   0.254   2.2359   22.36   18.7033   降低20%   30   0.2666   0.1149   0.1925   1.6754   16.75   降低20%   30   0.3167   0.1075   0.1828   1.7005   17   降低30%   30   0.3931   0.1031   0.2531   2.4549   24.55   20.2467   降低30%   30   0.4278   0.1615   0.2365   1.4644   14.64   降低30%   30   0.1701   0.1014   0.2185   2.1548   21.55   降低40%   30   0.2957   0.0805   0.2067   2.5677   25.67   21.3167   降低40%   30   0.3816   0.1069   0.188   1.7587   17.59   降低40%   30   0.3317   0.0905   0.1873   2.0696   20.69   血浆   15   0.3661   0.0844   0.1688   2.0000   20     22.3367   血浆   15   0.2843   0.0741   0.1689   2.2794   22.79   血浆   15   0.3869   0.0898   0.2175   2.4220   24.22   注:HC指高浓度对照带光密度值    LC指低浓度对照带光密度值  TD指测试带光密度值   S/CO指信噪比   (S指信号,CO指截止值)             AVE指平均值   SD指标准偏差      CV%指变化系数

太阳城集团对高浓度对照带、低浓度对照带和测试带报告的结果是反射密度(DR)。结 果显示:红细胞的存在对信噪比没有明显影响(S指信号,CO指截止值)。在非定 量测定,即定性测定中,信噪比>1意味着阳性,因为截止值(CO)是由大量阴性 样本的平均值决定的。当在双向流测定中样本加到窗口1上用anti-hRBC预处理的 #412膜时,这代表与施加血浆样本相比施加全血样本时HIV测试上的背景(在HIV 测试中)。测试带被测试为作为所使用基本度量的RI(定量的相对反射密度)。为 了避免同一批次产品的测试盒间的差,对照带(高对照带和低对照带)之一的反射 密度值(Dr)被用来计算测试带的RI,公式如下:RI(测试带)=测试反射密度值 (Test Dr)/高对照带(HC Dr)或低对照带(LC Dr)。这提供了更好的重复性,这 是因为测试带和高低对照带上的变化由RI来平衡。

示例九:胶体金涂敷方法对测定精度的影响

太阳城集团为了确定将共轭物涂敷在共轭物垫上的不同涂敷方法的效果,下面的实验用 清洗涂敷过程或者Bio-Jet喷射涂敷方法使用用胶体金标记的人抗IgG、或者胶体 金标记的乙型肝炎表面抗体涂敷的共轭物垫进行。将0.25毫克/毫升的兔抗人红细 胞预处理过的玻璃纤维膜#142用作样本过滤器,用清洗或者Bio-Jet喷射法涂敷 在玻璃共轭物垫(Pall Specialty Materials)上的胶体金标记的人抗IgG或者胶体金 标记的乙肝表面抗体可从Pall Specialty获得。实验在HIV测试盒中用HIV阳性全 血来进行,并在乙肝表面抗原测试盒中用HBsAg全血来进行。对乙肝表面抗原测 定(如示例七所述)在窗口2上的样本过滤器上添加血液样本,对于HIV测定(如 示例三所述)在窗口1的样本过滤器上添加血液样本,测定操作如上所述地进行, 实验结果在表13和14中示出。

表13:HIV测试(用清洗或者Bio-Jet喷射涂敷的共轭物)   涂敷   方法   样本   体积   (微升)   背景   HC Dr   LC Dr   TestDr   RI=TESTDR/   LCDR   S/CO   AVS/CO   清洗   HIV   阳性血   50   干净   0.1564   0.1785   0.1736   0.9725   9.7255   平均值   9.614   标准偏差   0.457   CV 4.76%   清洗   50   干净   0.1458   0.1793   0.1806   1.0073   10.0725   清洗   50   干净   0.1135   0.2106   0.2094   0.9943   9.943   清洗   50   干净   0.1356   0.1883   0.1683   0.8938   8.9379   清洗   50   干净   0.1079   0.1872   0.1758   0.9391   9.391   喷射   50   干净   0.1456   0.2281   0.2107   0.9237   9.2372   平均值   9.456   标准偏差     0.731   CV 7.7%   喷射   50   干净   0.1175   0.1758   0.1658   0.9431   9.4312   喷射   50   干净   0.1334   0.1606   0.1708   1.0635   10.6351   喷射   50   干净   0.1238   0.2301   0.2152   0.9352   9.3525   喷射   50   干净   0.1034   0.1898   0.1637   0.8625   0.8625

表14:HBsAg测试(用清洗或者Bio-Jet喷射涂敷的共轭物)   Jet   高对照   带DR   低对照   带DR   HbsA   g DR   RI=   HbsAg   DR/高对   照带DR   ng/ml   Resin   高对照   带DR   低对   照带   DR   HbsA   g DR   RI=   HbsAg   DR/高对   照带DR   ng/ml   1   0.2153   0.1433   0.0153   0.0711   3.9   1   0.23   0.25   0.011   0.0478   2.6   2   0.1879   0.1163   0.0144   0.0766   4.3   2   0.31   0.33   0.019   0.0613   3.4   3   0.1759   0.1245   0.0167   0.0949   5.5   3   0.34   0.34   0.017   0.0500   2.5   4   0.1419   0.0845   0.0135   0.0951   5.5   4   0.26   0.29   0.013   0.0500   2.6   5   0.1985   0.1242   0.0176   0.0887   5.1   5   0.36   0.35   0.02   0.0556   3   6   0.202   0.1267   0.014   0.0693   3.8   6   0.35   0.34   0.017   0.0486   2.6   7   0.1898   0.1291   0.0152   0.0801   4.5   7   0.34   0.33   0.019   0.0559   3   8   0.1764   0.1456   0.0143   0.0811   4.6   8   0.43   0.36   0.021   0.0488   2.5   9   0.2306   0.1917   0.0206   0.0893   5.1   9   0.36   0.36   0.18   0.0500   2.6   10   0.192   0.1168   0.0139   0.0724   4   10   0.35   0.34   0.019   0.0543   2.9   11   0.1895   0.1219   0.017   0.0897   5.2   11   0.27   0.28   0.016   00593   3.1   12   0.2355   0.1692   0.021   0.0892   5.1   12   0.39   0.36   0.02   0.0513   2.7   13   0.2369   0.1589   0.0156   0.0659   3.6   13   0.38   0.35   0.019   0.0500   2.7   14   0.2041   0.1543   0.015   0.0735   4.1   14   0.32   0.29   0.013   0.0406   2.1   15   0.2294   0.1633   0.0175   0.0763   4.3   15   0.37   0.33   0.019   0.0514   2.7   16   0.1611   0.0947   0.0146   0.0906   5.2   16   0.32   0.28   0.014   0.0438   2.3   17   0.2204   0.1518   0.0218   0.0989   5.8   17   0.2   0.22   0.013   0.0650   3.6   18   0.1785   0.1272   0.0151   0.0846   4.8   18   0.33   0.27   0.017   0.0515   2.7   19   0.2607   0.1911   0.0231   0.0886   5.1   19   0.32   0.26   0.019   0.0594   3.1   20   0.1884   0.1161   0.0162   0.0860   4.9   20   0.28   0.3   0.015   0.0536   2.9   AV   0.2007   0.1376   0.0166   0.0831   4.72   AV   0.3255   0.3115   0.0170   0.0524   2.780   SD   0.0289   0.0285   0.0028   0.0095   0.63   SD   0.0556   0.0417   0.0029   0.0058   0.3548   CV   11.5%   13.0%   CV   11.2%   12.8%

太阳城集团Dr代表的是反射密度,它和光密度值(OD)的计算方法一样,不同的是DR 指的是光反射密度。DR值是由ReLIA仪器生成的原始数据。对于清洗或者Bio-jet 喷射涂敷的共轭物的有关ng/ml的CV值都一样,所以测试精度也一样。

太阳城集团示例十:样本量对测定的影响。

太阳城集团为了确定样本量对本测定的精度的影响,进行了以下实验。在窗口1上用0.25 毫克/毫升的兔抗人红细胞预处理过的玻璃纤维膜#142被用作样本过滤器。血细胞 容积为45.3%的HIV阳性全血样本被添加到HIV测试盒中。血细胞比容为44%的 乙肝表面抗原阳性全血样本被添加到HBsAg测试盒中。向窗口2上的样本过滤器 添加变化的样本量。测定如前所述地进行。简而言之,通过向窗口1加样来进行对 全血的HIV测定。窗口1中的样本过滤器由用0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞预处 理过的玻璃纤维膜#142组成。当样本在测试带上往下流并停止时,向窗口2加缓 冲液。实验结果记录在表15中。

表15:变化血样量的HIV测试的比较   样本       加样量   (微升)       迁移速度   (毫米/分钟)       残留的   红细胞       NC   上的背景       高浓度对   照带(Dr)       低浓度对   照带(Dr)       测试带   (Dr)   RI=     测试Dr   /低浓度   Dr       S/CO       均值       CV     检测   太阳城集团     (分钟)   HIV   (+)   血样   30   .16   无   干净   0.4752   0.226   0   0   0     0     ---     20     30     .16     无     干净     0.4154     0.2432     0     0     0     30     .16     无     干净     0.4163     0.2317     0     0     0     40     .16     无     干净     0.2936     0.1979     0.2043     1.0323     10.3223     9.0592     12.9%     20     40     .16     无     干净     0.2697     0.1958     0.1731     0.8841     8.8396     40     .16     无     干净     0.2994     0.1986     0.1592     0.8016     8.0156     40     .16     无     干净     0.371     0.225     0.2507     1.1142     9.1408     9.5644     8.86%     30     40     .16     无     干净     0.1701     0.1983     0.209     1.054     10.5396     40     .16     无     干净     0.3206     0.1955     0.1762     0.9013     9.0128   50   ≤16   (+/-)   干净   0.2037   0.1697   0.2164   1.2752   12.7513   12.0134   65%   30   50   ≤16   (+/-)   干净   0.2572   0.1876   0.2271   1.2106   12.1034   50   ≤16   (+/-)   干净   0.0603   0.1729   0.1934   1.1186   11.1856     60     .16     (+)     干净     0.3271     0.2474     0.2005     0.8104     8.105     9.8273     20.42%     50     60     .16     (+)     干净     0.3456     0.1984     0.2387     1.2031     12.0302     60     .16     (+)     干净     0.1926     0.246     0.2299     0.9346     9.3467     70     .16     (+)     干净     0.1296     0.1983     0.1913     0.647     9.649     9.6556     8.4%     30     70     .16     (+)     干净     0.1387     0.245     0.2168     0.8849     8.8477     70     .16     (+)     干净     0.1119     0.2401     0.2514     1.0471     10.4702

在该HIV检测实验中,样本量的范围为30微升-70微升。30微升的样本量没 有产生任何可读实验结果。超过30微升的样本量则可产生可读实验结果。40微升 的样本量,无论实验是持续20分钟还是30分钟,都可获得可读结果。无论样本量 为多少,NC膜上的背景都是干净的。因此,40微升的样本量足够进行测定,而且 实验结果与50、60或者70微升的样本量的结果没有明显的不同。

太阳城集团表16  HBsAg检测中不同测定太阳城集团内变化样本量的比较   全血   (微升)   红细胞   漏出   血浆迁移   速率   (毫米/     分钟)   检测结果   20分钟   30分钟   40分钟   残留的     红细胞   HBsAg   (纳克/     毫升)     CV%   残留的     红细胞   HBsAg   (纳克/     毫升)     CV%   残留的     红细胞   HBsAg   (纳克/     毫升)     CV%   150   无   >16   (+/-)   3.2   42%   (-)   3.94   42%   (-)   4.1   46%   200   无   >16   (+)   3.267   9%   (+/-)   3.467   3%   (-)   3.267   19%   250   无   >16   (++)   2.633   6%   (+)   2.7   6%   (+/-)   2.7   4%   300   无   >16   (+++)   2.767   6%   (++)   2.833   9%   (++)   3.133   10%   350   --------   --------   ---------   --------   --------   血浆150   (微升)   30分钟   CV%   3.36   5%   注:CV指变化系数

来自乙肝表面抗原HbsAg检测的结果显示:150微升的样本量产生了高的CV 值。对于超过150微升的样本量,例如200微升、250微升、300微升,在20分钟 的实验中CV值处于6%-9%的比较低的范围;在30分钟的实验中CV值为3%-9%; 在40分钟的实验中CV值为4%到19%。对于250微升的样本量,无论实验太阳城集团 是20、30、还是40分钟,CV值都低于处于4%到6%的比较低的范围。因此250 微升的样本量足够进行实验,但是如果实验太阳城集团为20分钟或30分钟,则200微 升、250微升、300微升的样本量的实验结果没有明显的差异。如果实验太阳城集团为40 分钟而非20分钟或者30分钟,则200微升的实验CV值(19%)较高。

以上提到的一般形式的若干可选方案,例如吸收垫的放置、使用或者不使用 样本过滤器或者其对样本垫的代替、使用或者不使用凝集素、用亲水性膜取代疏水 性膜、在共轭物垫或者测试带本身上涂敷可检测试剂、或者省略在测试带上涂敷可 检测试剂、使用或略去缓冲液垫,或者共轭物垫的放置,都可以应用到特定形式中, 如图2、3、4、8、9、10或11所示,只要这些可选方案的变化与这些特定形式的 配置保持一致即可。

参考文献

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