太阳城集团

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用于器官的灌注液和/或保存溶液.pdf

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用于 器官 灌注 保存 溶液
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN200680006320.1

申请日:

20060113

公开号:

CN101128110A

公开日:

20080220

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01N1/00,A01N1/02 主分类号: A01N1/00,A01N1/02
申请人: 整骨疗法费城医学院
发明人: L·H·扬
地址: 美国宾夕法尼亚
优先权: 11/035,197
专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 代理人: 李华英
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法律状态
申请(专利)号:

CN200680006320.1

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明涉及用于保存、灌注和/或再灌注用于移植的器官特别是心脏的溶液。该溶液包含蛋白激酶CβII(PKCβII)和/或蛋白激酶Cξ(PKCξ)的肽抑制剂和/或蛋白激酶Cδ(PKCδ)的肽激活物。也公开了使用本发明的溶液的方法,包括用于保存移植用的器官、用于保护局部缺血的器官免受损伤、用于减轻局部缺血后器官的功能障碍、用于在局部缺血的器官中维持一氧化氮的释放和/或抑制过氧化释放以及用于当从循环系统分离时保护器官免受损伤的方法。

权利要求书

太阳城集团1.用于器官保存用的灌注、保存和/或再灌注的溶液,其包含蛋白激酶CβII(PKCβII)的至少一种肽抑制剂和/或蛋白激酶Cξ(PKCξ)的至少一种肽抑制剂和/或PKCδ的至少一种肽激活物。2.权利要求1的溶液,其中将所述肽抑制剂溶解在盐溶液中。3.权利要求1的溶液,其还包含氯化钾。4.权利要求1的溶液,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂是SEQ ID NO:1。5.权利要求1的溶液,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物是SEQ ID NO:3。6.权利要求1的溶液,其中所述PKCξ的至少一种肽抑制剂选自SEQ ID NO:2和G6983。7.权利要求1的溶液,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂的浓度是大约5-10μM。8.权利要求1的溶液,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物的浓度是大约5-10μM。9.权利要求1的溶液,其中所述PKCξ的至少一种肽抑制剂的浓度是大约2.5-5μM。10.权利要求1的溶液,其中所述器官是心脏。11.权利要求1的溶液,其中所述器官是哺乳动物的器官。12.权利要求11的溶液,其中所述哺乳动物是人。13.权利要求1的溶液,其中保存所述器官以用于移植。14.权利要求1的溶液,其中所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的。15.用于保存移植用器官的方法,其包括用权利要求1的溶液灌注所述器官的步骤。16.权利要求15的方法,其中将所述肽抑制剂/激活物溶解在盐溶液中。17.权利要求15的方法,其还包括氯化钾。18.权利要求15的方法,其中PKCβII的至少一种肽抑制剂是SEQ ID NO:1。19.权利要求15的方法,其中PKCδ5的至少一种肽激活物是SEQID NO:3。20.权利要求15的方法,其中PKCξ的至少一种肽抑制剂选自SEQ ID NO:2和G6983。21.权利要求15的方法,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂的浓度是大约5-10μM。22.权利要求15的方法,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物的浓度是大约5-10μM。23.权利要求15的方法,其中所述PKCξ的至少一种肽抑制剂的浓度是大约2.5-5μM。24.权利要求15的方法,其中所述器官是心脏。25.权利要求15的方法,其中所述器官是哺乳动物的器官。26.权利要求15的方法,其中所述哺乳动物是人。27.权利要求15的方法,其中保存所述器官以用于移植。28.权利要求15的方法,其中所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的。29.权利要求15的方法,其还包含将所述器官浸没在权利要求1的溶液中的步骤。30.权利要求15的方法,其中以低于大约20mL/分钟的速率进行灌注步骤。31.权利要求15的方法,其中以大约1mL/分钟的速率进行灌注步骤。32.权利要求15的方法,其中所述灌注步骤是逆行灌注。33.权利要求15的方法,其中所述灌注步骤持续大约5分钟。34.用于保护局部缺血的器官免受损伤的方法,其包括用权利要求1的溶液灌注所述器官的步骤。35.权利要求34的方法,其中将所述肽抑制剂/激活物溶解在盐溶液中。36.权利要求34的方法,其还包括氯化钾。37.权利要求34的方法,其中PKCβII的至少一种肽抑制剂是SEQ ID NO:1。38.权利要求34的方法,其中PKCδ的至少一种肽激活物是SEQID NO:3。39.权利要求34的方法,其中PKCξ的至少一种肽抑制剂选自SEQ ID NO:2和G6983。40.权利要求34的方法,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂的浓度是大约5-10μM。41.权利要求34的方法,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物的浓度是大约5-10μM。42.权利要求34的方法,其中所述PKCξ的的至少一种肽抑制剂的浓度是大约2.5-5μM。43.权利要求34的方法,其中所述器官是心脏。44.权利要求34的方法,其中所述器官是哺乳动物的器官。45.权利要求44的方法,其中所述哺乳动物是人。46.权利要求34的方法,其中保存所述器官以用于移植。47.权利要求34的方法,其中所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的。48.权利要求34的方法,其还包含将所述器官浸没在权利要求1的溶液中的步骤。49.权利要求34的方法,其中以低于大约20mL/分钟的速率进行灌注步骤。50.权利要求34的方法,其中以大约1mL/分钟的速率进行灌注步骤。51.权利要求34的方法,其中所述灌注步骤是逆行灌注。52.权利要求34的方法,其中所述灌注步骤持续大约5分钟。53.用于减轻局部缺血后器官功能障碍的方法,其包括用权利要求1的溶液灌注所述器官的步骤。54.权利要求53的方法,其中将所述肽抑制剂/激活物溶解在盐溶液中。55.权利要求53的方法,其还包括氯化钾。56.权利要求53的方法,其中PKCβII的至少一种肽抑制剂是SEQ ID NO:1。57.权利要求53的方法,其中PKCδ的至少一种肽激活物是SEQID NO:3。58.权利要求5 3的方法,其中PKCξ的至少一种肽抑制剂选自SEQ ID NO:2和G6983。59.权利要求53的方法,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂的浓度是大约5-10μM。60.权利要求53的方法,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物的浓度是大约5-10μM。61.权利要求53的方法,其中所述PKCξ的的至少一种肽抑制剂的浓度是大约2.5-5μM。62.权利要求53的方法,其中所述器官是心脏。63.权利要求53的方法,其中所述器官是哺乳动物的器官。64.权利要求63的方法,其中所述哺乳动物是人。65.权利要求53的方法,其中保存所述器官以用于移植。66.权利要求53的方法,其中所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的。67.权利要求53的方法,其还包含将所述器官浸没在权利要求1的溶液中的步骤。68.权利要求53的方法,其中以低于大约20mL/分钟的速率进行灌注步骤。69.权利要求53的方法,其中以大约1mL/分钟的速率进行灌注步骤。70.权利要求53的方法,其中所述灌注步骤是逆行灌注。71.权利要求53的方法,其中所述灌注步骤持续大约5分钟。72.用于在局部缺血的器官中维持一氧化氮释放的方法,其包括用权利要求1的溶液灌注所述器官的步骤。73.权利要求72的方法,其中将所述肽抑制剂/激活物溶解在盐溶液中。74.权利要求72的方法,其还包括氯化钾。75.权利要求72的方法,其中PKCβII的至少一种肽抑制剂是SEQ ID NO:1。76.权利要求72的方法,其中PKCδ的至少一种肽激活物是SEQID NO:3。77.权利要求72的方法,其中PKCξ的至少一种肽抑制剂选自SEQ ID NO:2和G6983。78.权利要求72的方法,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂的浓度是大约5-10μM。79.权利要求72的方法,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物的浓度是大约5-10μM。80.权利要求72的方法,其中所述PKCξ的的至少一种肽抑制剂的浓度是大约2.5-5μM。81.权利要求72的方法,其中所述器官是心脏。82.权利要求72的方法,其中所述器官是哺乳动物的器官。83.权利要求82的方法,其中所述哺乳动物是人。84.权利要求72的方法,其中保存所述器官以用于移植。85.权利要求72的方法,其中所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的。86.权利要求72的方法,其还包括将所述器官浸没在权利要求1的溶液中的步骤。87.权利要求72的方法,其中以低于大约20mL/分钟的速率进行灌注步骤。88.权利要求72的方法,其中以大约1mL/分钟的速率进行灌注步骤。89.权利要求72的方法,其中所述灌注步骤是逆行灌注。90.权利要求72的方法,其中所述灌注步骤持续大约5分钟。91.用于在从循环系统分离后保护器官免受损伤的方法,其包括用权利要求1的溶液灌注所述器官的步骤。92.权利要求91的方法,其中将所述肽抑制剂/激活物溶解在盐溶液中。93.权利要求91的方法,其还包括氯化钾。94.权利要求91的方法,其中PKCβII的至少一种肽抑制剂是SEQ ID NO:1。95.权利要求91的方法,其中PKCδ的至少一种肽激活物是SEQID NO:3。96.权利要求91的方法,其中PKCξ的至少一种肽抑制剂选自SEQ ID NO:2和G6983。97.权利要求91的方法,其中所述PKCβII的至少一种肽抑制剂的浓度是大约5-10μM。98.权利要求91的方法,其中所述PKCδ的至少一种肽激活物的浓度是大约5-10μM。99.权利要求91的方法,其中所述PKCξ的的至少一种肽抑制剂的浓度是大约2.5-5μM。100.权利要求91的方法,其中所述器官是心脏。101.权利要求91的方法,其中所述器官是哺乳动物的器官。102.权利要求101的方法,其中所述哺乳动物是人。103.权利要求91的方法,其中保存所述器官以用于移植。104.权利要求91的方法,其中所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的。105.权利要求91的方法,其还包括将所述器官浸没在权利要求1的溶液中的步骤。106.权利要求91的方法,其中以低于大约20mL/分钟的速率进行灌注步骤。107.权利要求91的方法,其中以大约1mL/分钟的速率进行灌注步骤。108.权利要求91的方法,其中所述灌注步骤是逆行灌注。109.,权利要求91的方法,其中所述灌注步骤持续大约5分钟。

说明书



发明领域

本发明涉及用于保存、灌注和/或再灌注用于移植的器官特别是心脏的溶液。该溶液包含蛋白激酶CβII(PKCβII)和/或蛋白激酶Cξ(PKCξ)的肽抑制剂和/或蛋白激酶Cδ(PKCδ)的肽激活物。

发明背景

成功的器官移植通常因局部缺血/再灌注损伤的原因而受到限制。缺氧超过4小时的分离的人的心脏逐渐失去活力且通常在受体宿主中不能存活。其他器官例如肾、肝脏、胰腺和肺,当在移植前从其宿主中取出时,也遭受组织和细胞损伤。该损伤是由于低氧状态和缺乏循环造成的,所述循环通常递送生理浓度的氧和营养物和清除由器官的细胞产生的毒性化合物。当从其宿主切取后立即进行移植时,器官移植具有更高的成功率。

近年来的进步已增加了成功的器官移植和器官手术例如冠状动脉旁路手术的比例。首先包括器官保存和器官灌注液。第二是用于递送器官灌注液至器官的改进的方法和装置。

太阳城集团目前通过在心脏停搏后冷冻贮藏来提供短期心肌保护。存在多种方法,然而它们的差异在于所用溶液的组成、保存温度和施用方案。已发展了用于使心脏停跳和保存心脏的不同溶液以在心脏手术中保护心肌。这些溶液的实例包括克-汉二氏溶液(Krebs-Henseleitsolution)、UW溶液、St.Thomas II溶液、Collins溶液和Stanford溶液。(参见,例如,美国专利Nos.4,798,824和4,938,961;Southard和Belzer,Ann.Rev.Med.46:235-247(1995);以及Donnelly和Djuric,Am.J.Hosp.Pharm.48:2444-2460(1991))。然而,由于在取出的太阳城集团和在受体中恢复血流的太阳城集团之间移植的器官的状况恶化的原因,器官排异反应仍然存在。

血流的恢复是在例如移植期间治疗经历长太阳城集团局部缺血的器官组织的首要目的。然而,血流的再灌注引起内皮和肌细胞损伤,从而导致器官功能障碍(Buerke等人,Am J Physiol 266:H128-136,1994;Lucchesi和Mullane,Ann Rev Pharmacol Toxicol 26:2011-2024,1986;和Lucchesi等人,J MoI Cell Cardiol 21:1241-1251,1989)。与再灌注损伤相关的系列事件由特征在于再灌注后前2.5-5分钟内的基底内皮细胞释放一氧化氮(NO)的下降的内皮功能障碍引发(Tsao和Lefer,Am J Phyiol 259:H1660-1666,1990)。内皮细胞产生的NO的减少与内皮细胞膜和多形核(PMN)白细胞膜上的粘附分子上调相关(Ma等人,Cire Res 72:403-412,1993;和Weyrich等人,J LeukoBiol 57:45-55,1995)。该事件促进了再灌注后10至20分钟之内发生的PMN/内皮相互作用,且再灌注后30分钟内观察到随后的PMN至心肌的浸润(Lefer和Hayward,In The Role of Nitric Oxide inIschemia-Reperfusion:Contemporary Cardiology,Loscalzo等人(Eds.),Humana Press,Totowa,NJ,pp.357-380,2000;Lefer和Lefer,Cardiovasc Res 32:743-751,1996;Tsao等人,Circulation82.1402-1412,1990;和Weyrich等人,J Leuko Biol 57:45-55,1995)。

太阳城集团从再灌注组织释放的趋化物质和血浆因子激活PMN,这促进了PMN在局部缺血/再灌注后释放细胞毒性物质(即过氧化物阴离子)并促成了器官功能障碍(Lucchesi等人J Mol Cell Cardiol 21:1241-1251,1989;Ma等人,Circ Res 69:95-106,1991;Tsao等人,Circulation82:1402-1412,1990;和Tsao等人,Am Heart J 123:1464-1471,1992)。过氧化物结合NO以产生过硝酸盐阴离子,从而减少了NO的生物利用度和在心肌局部缺血/再灌注后促进内皮功能障碍和PMN浸润(Clancey等人,J Clin Invest 90:1116-1121,1992;Hansen,Circulation 91:1872-85,1995;Lucchesi等人,J Mol Cell Cardiol21:1241-1251,1989;Rubanyi和Vanhoutte,Am J Physiol 250:H815-821,1986;Tsao等人,Am Heart J 123:1464-1471,1992;和Weiss,New Eng J Med 320:365-375,1989)。

因此,存在对提高的质量的溶液的需要,该溶液可延长用于移植的器官的保存太阳城集团和保护器官免受局部缺血后再灌注损伤,从而使器官可在血流恢复后重新开始适当的功能。

发明概述

本发明提供了用于器官特别是心脏的保存、灌注和/或再灌注的溶液,其包含蛋白激酶CβII(PKCβII)和/或蛋白激酶Cξ(PKCξ)的肽抑制剂和/或蛋白激酶Cδ(PKCδ)的肽激活物。当从循环系统分离器官或器官经历减少的血流(局部缺血)时,所述溶液保护所述器官组织和细胞免受损伤。本发明者已发现蛋白激酶CβII和/或蛋白激酶Cξ的肽抑制剂和/或蛋白激酶Cδ(PKCδ)的肽激活物增加NO释放或抑制内皮/PMN过氧化物释放,这可在经历局部缺血/再灌注的器官中产生保护效应。

太阳城集团在一个实施方案中,所述溶液包含溶解在盐溶液中的大约5-10μM PKCβII的肽抑制剂和/或大约2.5-5μM PKCξ的肽抑制剂和/或5-10μM PKCδ的肽激活物。

本发明的溶液可用作灌注液或保存液。作为灌注液,将其灌注入器官的脉管系统以保护所述器官组织和细胞。作为保存液,其用作将器官浸没于其中的浴液。优选地,用本溶液灌注器官并将器官浸没在其中。此外,当局部缺血后对器官恢复血流时,本发明的溶液也用作再灌注溶液。

太阳城集团本发明也包括使用本发明的溶液的方法。这些方法包括用于保存移植用的器官、用于保护局部缺血的器官免受损伤、用于在局部缺血后减轻器官功能障碍、用于维持局部缺血的器官中的一氧化氮的释放和用于当从循环系统分离时保护器官免受损伤的方法。

附图概述

太阳城集团图1.假手术、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂(5μM)灌注的大鼠心脏中的LVDP(左心室形成压=左心室收缩末期压-左心室舒张末期压)的时程。开始时(基线)和局部缺血20分钟后0至45分钟的再灌注时的LVDP数据。假手术组(n=6)在整个80分钟的方案中保持相同的LVDP。I/R(n=6)组恢复至初始基线值。I/R+PMN组(n=6),与I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂(n=6)组相比,表示显著的和持续的LVDP的减少。所有值都表示为平均值±SEM。*p<0.05和**p<0.01,I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂组与I/R+PMN相比。

太阳城集团图2.来自局部缺血前(I)(初始)和再灌注(R)后45分钟(终)的分离的经灌注的大鼠心脏的以mmHg表示的初始和终LVDP。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导显著的收缩功能障碍,该收缩功能障碍可被PKCξ肽抑制剂减轻,但被NG-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME)显著地阻断。所有的值表示为平均值±SEM。被检查的心脏数目示于柱的底部。**p<0.01,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

太阳城集团图3.局部缺血前(I)和再灌注后(R)的分离的经灌注的大鼠心脏中以mmHg/s表示的初始和终最大LVDP(+dP/dtmax)率。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导明显的收缩功能障碍,该收缩功能障碍被PKCξ肽抑制剂减轻,但被L-NAME阻断。所有值都以平均值±SEM表示。所检查的心脏的数目示于柱的底部。**p<0.01,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

太阳城集团图4a.分离的灌注的大鼠心脏样品(从每组3只大鼠和每个心脏10个区域采集所述样品)中的总的血管内PMN和浸润PMN的组织学评价。PKCξ肽抑制剂显著减少再灌注后的心肌组织中的和附着至冠状脉管系统的总的血管内和浸润的PMN的数目。阴影标示的块(box)代表非PMN灌注的心脏,黑色块表示PMN灌注的心脏。**P<0.01,与I/R+PMN相比。

图4b.分离的经灌注的大鼠心脏样品(从每组3只大鼠和每个心脏10个区域采集所述样品)中附着至冠状脉管系统的血管内PMN的组织学评价。附着至冠状脉管系统的PMN的数目与I/R+PMN差异不显著。阴影线标示的块代表非PMN灌注的心脏,黑色块代表PMN灌注的心脏。所有值为心脏面积±SEM的PMN的平均数目/mm2。

图5.来自大鼠主动脉节段的NO释放的测量。在PKCξ肽抑制剂(2.5-15μM)处理的和乙酰胆碱(Ach,200nM)处理的节段中,内皮NO释放与基线NO释放相比显著地增加。在提供400μM L-NAME的两个组中和除去内皮的(裸露的)节段中,NO释放显著减少。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目是每组分开实验的次数。*p<0.05,**p<0.01,与基线值相比。

图6.来自大鼠PMN的过氧化物的释放。在佛波醇-12-十四酸酯-13-醋酸盐(PMA)(15nM)刺激后从5×106个PMN测量过氧化物的释放。过氧化物歧化酶(SOD)(10μg/ml)用作阳性对照。在加入PMA后360秒测量吸光率的改变(Δ)(峰响应)。过氧化物释放显著地被PKCξ肽抑制剂抑制(**p<0.01、2.5、5和15μM)。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目是每组分开实验的次数。

图7.假手术I/R、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+βII肽抑制剂(10μM)灌注的大鼠心脏中的LVDP的时程。初始时(基线)和20分钟局部缺血后0至45分钟再灌注时的LVDP数据。假手术组(n=6)在整个80分钟的方案中保持相同的LVDP。I/R+PMN组(n=9),与I/R(n=6)和I/R+PMN+βII肽抑制剂组(n=7)相比,表现明显的和持续的LVDP的减少。所有值都表示为平均值±SEM。*p<0.05和**p<0.01,与I/R+PMN相比。

太阳城集团图8.来自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R)45分钟(终)的分离的经灌注的大鼠心脏的以mmHg表示的初始和终LVDP。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导显著的收缩功能障碍,该收缩功能障碍可被PKCβII肽抑制剂减轻,但因L-NAME的存在而显著地被阻止。所有的值表示为平均值±SEM。所检查的心脏的数目示于柱的底部。**p<0.05和**p<0.01,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

图9.局部缺血前(I)和再灌注后(R)的分离的经灌注的大鼠心脏中以mmHg/s表示的初始和终+dP/dtmax。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导明显的收缩功能障碍,该收缩功能障碍被PKCβII肽抑制剂减轻,但被L-NAME阻断。所有值都以平均值±SEM表示。所检查的心脏的数目示于柱的底部。*p<0.05和**p<0.01,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

太阳城集团图10.来自大鼠主动脉节段的NO释放的测量。在PKCβII肽抑制剂(1、2.5、5和10μM)处理和乙酰胆碱(Ach,500nM)处理的节段中,内皮NO释放与基线NO释放相比显著地增加。在提供400μM L-NAME的两个组中,NO释放显著减少。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目是每组分开的实验的次数。*p<0.05,**p<0.01,与基线值相比。

太阳城集团图11.来自大鼠PMN的过氧化物的释放。在甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)(200nM)刺激后从5×106个PMN测量过氧化物的释放。SOD(10μg/ml)用作阳性对照。在fMLP加入后90秒测量吸光率的改变(Δ)(峰响应)。PKCβII肽抑制剂抑制剂(**p<0.01,5、10和20μM)显著地抑制过氧化物释放。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目是每组分开实验的次数。

图12.假手术、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂灌注的大鼠心脏中的LVDP的时程。初始时(基线)和20分钟局部缺血后0至45分钟再灌注时的LVDP数据。假手术组(n=6)在整个80分钟的方案中保持相同的LVDP。I/R组(n=6)部分地恢复至初始基线值。I/R+PMN组(n=11),与I/R+PMN+PKC βII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂组(n=7)相比,表现了明显的和持续的LVDP的减少。所有值都表示为平均值±SEM。*p<0.05,与I/R+PMN相比。

图13.来自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R)45分钟(终)的分离的经灌注的大鼠心脏的以mmHg表示的初始和终LVDP。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导显著的收缩功能障碍,该收缩功能障碍在PKCβII和PKCξ肽抑制剂存在的情况下被减轻。该保护效应被L-NAME阻断。所有的值表示为平均值±SEM。所检查的心脏的数目标示在柱的底部。**p<0.05,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

太阳城集团图14.局部缺血前(I)和再灌注后(R)的分离的经灌注的大鼠心脏中以mmHg/s表示的初始和终+dP/dt max。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导明显的收缩功能障碍,该收缩功能障碍被PKCβII和PKCξ肽抑制剂减轻。该保护效应被L-NAME阻断。所有值都以平均值±SEM表示。所检查的心脏的数目标示在柱的底部。*p<0.05,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

图15.分离的经灌注的大鼠心脏样品(从每组3只大鼠和每个心脏10个区域采集所述样品)中总的血管内和浸润的PMN的组织学评价。PKCβII和PKCξ肽抑制剂显著地减少再灌注后的心肌组织中的和附着至冠状脉管系统的总的血管内和浸润的PMN的数目。阴影线块代表非PMN灌注的心脏,黑色块代表PMN灌注的心脏。**P<0.01,与I/R+PMN相比。

太阳城集团图16.附着至分离的经灌注的大鼠心脏中的冠状脉管系统的血管内PMN的组织学评价。附着至用PKCβII和PKCξ肽抑制剂处理的心脏的冠状脉管系统的PMN的数目比I/R+PMN心脏低。阴影线块代表非PMN灌注的心脏,黑色块代表PMN灌注的心脏。所有值都以心脏面积±SEM的PMN的平均数目/mm2表示。**P<0.01,与I/R+PMN相比。

图17.来自大鼠主动脉节段的NO释放的测量。在PKCβII和PKCξ肽抑制剂处理和乙酰胆碱(Ach,500nM)处理的节段中,内皮NO释放与基线NO释放相比显著地增加。在提供400μM L-NAME的两个组中,NO释放都显著减少。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目是每组分开的实验的次数。**p<0.01,与基线值相比。

太阳城集团图18.来自大鼠PMN的过氧化物的释放。在PMA(15nM)刺激后从5×106个PMN测量过氧化物的释放。SOD(10μg/ml)用作阳性对照。在PMA加入后360秒测量吸光率的改变(Δ)(峰响应)。过氧化物释放显著地被PKCβII和PKCξ肽抑制剂抑制(*p<0.05,**p<0.01)。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目表示每组分开实验的次数。

太阳城集团图19.假手术I/R、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKCδ肽激活物(10μM)灌注的大鼠心脏中的LVDP的时程。初始时(基线)和20分钟的局部缺血后0至45分钟再灌注时的LVDP数据。假手术组(n=6)在整个80分钟的方案中保持相同的LVDP。I/R(n=6)组恢复至初始基线值。I/R+PMN组(n=6),与I/R+PMN+PKCδ肽激活物(n=6)组相比,表现明显的和持续的LVDP的减少。所有值都表示为平均值±SEM。**p<0.01,与I/R+PMN相比。

图20.来自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R)45分钟(终)的分离的经灌注的大鼠心脏的以mmHg表示的初始和终LVDP。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导显著的收缩功能障碍,该收缩功能障碍被PKCδ肽激活物减轻。所有的值都表示为平均值±SEM。所检查的心脏的数目标示在柱的底部。*p<0.05和**p<0.01,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

图21.来自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R)的分离的经灌注的大鼠心脏的以mmHg表示的初始和终+dP/dt max。在PMN存在或不存在的情况下灌注心脏。PMN诱导显著的收缩功能障碍,该收缩功能障碍被PKCδ肽激活物减轻。所有的值都表示为平均值±SEM。检查的心脏的数目示于柱的底部。**p<0.01,与终I/R+PMN相比;NS=不显著。

图22.来自大鼠PMN的过氧化物的释放。在PMA(15nM)刺激后从5×106个PMN测量过氧化物的释放。在PMA加入后360秒测量吸光率的改变(Δ)(峰响应)。过氧化物释放显著地被PKCδ肽激活物抑制(**p<0.01,5和10μM)。所有值都表示为平均值±SEM。柱底部的数目表示每组分开实验的次数。

太阳城集团图23a.分离的经灌注的大鼠心脏样品(从每组3只大鼠和每个心脏10个区域采集所述样品)中总的血管内和浸润的PMN的组织学评价。PKCδ肽激活物显著减少再灌注后的心肌组织中的和附着至冠状脉管系统的总的血管内和浸润的PMN的数目。阴影线标示的块代表非PMN灌注的心脏,黑色块代表PMN灌注的心脏。

图23b.分离的经灌注的大鼠心脏样品(从每组3只大鼠和每个心脏10个区域采集所述样品)中附着至冠状脉管系统的血管内PMN的组织学评价。PKCδ肽激活物减少了附着至冠状脉管系统的PMN的数目。阴影线标示的块代表非PMN灌注的心脏,黑色块代表PMN灌注的心脏。所有值都是心脏面积±SEM的PMN/mm2的平均数目。

图24.假手术的、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKCδ肽激活物(10μM)灌注的大鼠心脏中的左心室舒张末期压(LVEDP)的时程。初始时(基线)和20分钟的局部缺血后0至45分钟的再灌注时的LVEDP数据。假手术组(n=6)在整个80分钟的方案中保持相同的LVEDP。I/R(n=6)组部分恢复至初始基线值。I/R+PMN组(n=6),与I/R+PMN+PKCδ肽激活物组(n=6)相比,表现显著和持续的LVEDP的升高。所有值都表示为平均值±SEM。*p<0.05和**p<0.01,与I/R+PMN相比。

优选实施方案的详述

本发明提供了用于保存、灌注和/或再灌注器官特别是心脏的溶液。所述溶液包含蛋白激酶CβII(PKCβII)和/或蛋白激酶Cξ(PKCξ)的肽抑制剂和/或PKCδ的肽激活物。优选地,PKCβII的肽抑制剂或PKCδ的肽激活物以大约5-10μM的量存在于溶液中;PKCξ的肽抑制剂以大约2.5-5μM的量存在。

在优选的实施方案中,PKCβII的肽抑制剂具有SPQ ID NO:1的氨基酸序列;PKCξ的肽抑制剂具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列;所述肽激活物具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。同样,在其他实施方案中,优选地所述肽抑制剂/激活物是十四烷基化的以提高进入器官的细胞的吸收。

太阳城集团在优选实施方案中,将所述肽抑制剂或肽激活物溶解在盐溶液优选地生理盐水(0.9%NaCl)溶液中。也可将所述肽抑制剂溶解在已知的保存液例如Krebs-Henseleit溶液、UW溶液、St.Thomas II溶液、Collins溶液、Stanford溶液等中。所述溶液也可包含浓度分别为大约4-7mM、大约0.2-0.3mM、大约108-132mM、大约13-16mM、大约18-22mM、大约2-4mM、大约0.5-1mM、大约27-33mM、大约0.9-1.1mM、大约2.7-3.3mM、大约25-35mM和大约80-120mM的钠(Na+)、钾(K+)、钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、谷氨酸、精氨酸、腺苷、甘露醇(manitol)、别嘌呤醇、谷光苷肽、棉子糖和乳糖酸中的一种或多种。Na+可以以NaOH的形式存在;K+可以以KCl和/或KH2PO4的形式存在,最优选以大约2-3.5mM KCl和大约2-3.5mM KH2PO4的比例存在;Ca2+可以以CaCl2的形式存在;而Mg2+可以以MgCl2的形式存在。所述溶液优选地保持大约7.2-7.4的生理pH。

本发明的溶液可在器官特别是心脏、移植体的所有时期中使用,所述时期包括,但不限于1)从供体分离器官(心脏停跳液);2)保存器官(低温保存/运输);和3)在受体中再植入器官(再灌注液)。

在灌注或再灌注期间,特别是对于心脏,优选地以大约1mL/分钟的速率灌注器官大约5分钟。可改变灌注速率,但其不应当超过大约25mL/分钟。总之,灌注速率不应当高至对器官的脉管系统产生过度的压力。

可通过1)将肽抑制剂和不同的组分溶解和稀释在蒸馏水中;2)用例如用NaOH将pH调节至大约7.2-7.4;和3)通过例如用0.2μm过滤器过滤使溶液灭菌来制备本发明的溶液。然后将灭菌的溶液与环境中的污染物保持分离。

无需进一步描述,一般认为本领域技术人员通过使用前面的描述和下列举例说明的实施例可制备和使用本发明的化合物并实践所述方法。提供下列实施例以举例说明本发明。应当理解本发明不限定于实施例中描述的特定条件或细节。

实施例1PKCξ的肽抑制剂的作用

太阳城集团通过60mg/kg戊巴比妥钠腹膜内(i.p.)注射来麻醉雄性SpragueDawley大鼠(275-325g,Ace Animals,Boyertown,PA)。也通过腹膜内注射施用肝素钠(1,000U)。快速切取心脏,将导管插入升主动脉,然后在80mmHg恒定压力下用维持在37℃的改良的Krebs缓冲液开始逆行灌注心脏。所述Krebs缓冲液具有下列组成(以mmol/l表示):17葡萄糖、120NaCl、25NaHCO3、2.5CaCl2、0.5EDTA、5.9KCl和1.2MgCl2。用95%O2和5%CO2充入灌注液并将其在pH 7.3-7.4下平衡。靠近心脏流入插管的灌注管中的两个侧臂允许PMN、无PKCξ肽抑制剂的血浆(对照心脏)或包含不同浓度的PKCξ肽抑制剂(1、2.5或5μM)的血浆直接灌注入冠脉流入管。由流量计(T106,TransonicSystem,Inc.,Ithaca,NY)监测冠脉血流量。使用压力传感器(SPR-524,Millar Instruments,Inc.,Houston,TX)监测LVDP和+dP/dtmax,将所述压力传感器置于左室腔中。将心脏浸在装有160mL维持在37℃的Krebs缓冲液的水套贮器中。使用与计算机连接的Powerlab Station采集系统(ADInstruments,Grand Junction,CO)记录冠脉血流量、LVDP和+dP/dtmax。

太阳城集团每5分钟测量LVDP、+dP/dtmax和冠脉血流量,进行15分钟,以平衡心脏和获得基线测量。将LVDP定义为左心室收缩末期压减去左心室舒张末期压。15分钟后,将Krebs缓冲液的流量减少至0,进行20分钟,以引发全心缺血。在再灌注时,以1mL/分钟的速率用悬浮在5mLKrebs缓冲液和5mL血浆中的200×106个PMN灌注心脏5分钟。在一些实施方案中,以1、2.5或5μM的终浓度向血浆中加入PKCξ肽抑制剂(Genemed Synthesis,Inc.,San Francisco,CA)。假手术I/R心脏不接受局部缺血和不用PMN灌注。

太阳城集团使用下列分离的经灌注的大鼠心脏组:

太阳城集团组1:假手术的局部缺血/再灌注(I/R)心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注,但在进入灌注的第35分钟时用5mL血浆(1mL/分钟)(在相同的太阳城集团点给I/R心脏提供5mL血浆,15分钟的基线记录和20分钟的局部缺血)进行灌注。这些心脏代表用于确定分离的大鼠心脏在整个80分钟的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax的对照组(n=6)。

组2:假手术I/R+PKCξ肽抑制剂(5μM)心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注。在进入灌注的第35分钟给这些心脏施用PKCξ肽抑制剂(5μM,将在水中配制的5mM母液溶解在血浆中)。该组(n=6)用于确定PKCξ肽抑制剂是否引起强心作用或心脏功能抑制作用。

组3:将I/R心脏接受20分钟的局部缺血,然后在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注,但不用PMN灌注。这些心脏代表了对照组(n=6),用于确定20分钟的局部缺血之后进行再灌注是否使心脏昏迷(stun),但在45分钟的再灌注期结束时LVDP和+dP/dtmax将恢复至基线值(初始值)。

第4组:将I/R+PKCξ肽抑制剂(5μM,溶解在血浆中)心脏接受20分钟的局部缺血但不用PMN灌注。在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆+PKCξ抑制剂灌注这些心脏。该组(n=6)用于确定PKCξ肽抑制剂是否在无PMN的I/R背景中引起心脏功能抑制作用。

太阳城集团组5:将I/R+PMR心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)和PMN(重悬浮于5mL Krebs缓冲液中)进行灌注。这些心脏代表对照组(n=6),该对照组用于确定20分钟的局部缺血后在PMN(200×106)存在的情况下进行45分钟的再灌注在整个45分钟的再灌注期间是否导致,与初始基线值(n=6)相比,持续的心肌收缩功能障碍。

太阳城集团组6:将I/R+PMNs+PKCξ肽抑制剂(1μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用1μM PKCξ肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表用于确定PKCξ抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

组7:将I/R+PMNs+PKCξ肽抑制剂(2.5μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用2.5μM PKCξ肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表用于确定PKCξ抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

太阳城集团组8:将I/R+PMNs+PKCξ肽抑制剂(5μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5μM PKCξ肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表用于确定更高PKCξ肽抑制剂浓度上的PKCξ抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

组9:将I/R+PMNs+PKCξ肽抑制剂(5μM)+NG-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME,50μM)心脏接受20分钟的局部缺血,然后在再灌注的第一个5分钟期间用5μM PKCξ肽抑制剂(溶解在5mL血浆中)和50μML-NAME(将50mM水中配制的母液溶解在Krebs缓冲液中)和PMN(200×106)进行灌注。在整个连续的45分钟的再灌注期将L-NAME(50μM)连续灌注入心脏。这些心脏代表组(n=5),所述组用于确定使用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)是否可阻断PKCξ肽抑制的心脏保护作用。

太阳城集团在再灌注后的45分钟中,每5分钟记录数据。在进行各实验后,分离左心室,将其在4%的多聚甲醛中固定并在4℃下贮存以备用于以后的组织学分析。

图1显示心肌收缩功能(即,LVDP)的时程。来自假手术I/R、I/R、I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂(5μM)和I/R+PMN组的数据说明在80分钟的灌注期期间LVDP的相对变化。如所显示的,假手术I/R在整个灌注期保持在初始基线值的100%的附近或大于初始基线值的100%。I/R心脏在再灌注开始时经历LVDP的降低,但在再灌注结束时恢复至初始基线值的95±7%。相反地,遭受严重心肌收缩功能障碍的I/R+PMN心脏在再灌注后45分钟时只恢复至初始基线值的47±7%。相反地,I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂(5μM)心脏在灌注后45分钟时恢复至84±4%。

太阳城集团为确定PKCξ肽抑制剂对心肌收缩功能是否产生直接的收缩能效应,用PKCξ肽抑制剂(5μM)灌注非局部缺血性假手术I/R心脏。使用PKCξ肽抑制剂处理假手术I/R心脏在80分钟的灌注期不导致LVDP(图2)或+dP/dt(图3)的任何显著改变,表明5μM的PKCξ肽抑制剂对心肌收缩功能不产生直接作用。开始检测了15μM PKCξ肽抑制剂浓度,因为该浓度对应于85%的PMN过氧化物释放抑制。然而,15μM产生心脏功能抑制作用(假手术I/R心脏的LVDP降低了50%),从而不能用于这些实验(数据未显示)。

太阳城集团图2和3显示来自分离的经灌注的大鼠心脏的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值。对于所有组初始基线都相似。然而,与其初始基线相比,对于用PMN再灌注的I/R心脏,终LVDP和+dP/dtmax(再灌注后45分钟)分别显著地减少了(p<0.01)47±7%和41±7%。PKCξ肽抑制剂(2.5μM和5μM浓度)显著地减弱了与使用PMN的局部缺血后的再灌注相关的LVDP和+dP/dtmax的下降。在接受5μM的药物的组中,对于终LVDP和+dP/dtmax,与其初始基线相比,心脏恢复至84±4%和76±5%。在2.5μM观察到最低有效剂量;与初始基线值相比,对于LVDP这些心脏恢复至83±4%,对于dP/dtmax恢复至75±5%。在L-NAME(50μM)存在的情况下,PKCξ肽抑制剂(5μM)的心脏保护作用被阻断。在再灌注后45分钟,对于LVDP和+dP/dtmax,与其初始基线相比,心脏分别只恢复至58±7%和54±9%。这些心脏与IR+PMN组(47±7%和41±7%的LVDP、+dP/dtmax)相似。在再灌注后45分钟,对于LVDP和+dP/dtmax,与其初始基线相比,在1μM PKcξ肽抑制剂处理的心脏接触I/R+PMN后分别只恢复至57±10%和46±6%。在该较低的剂量上,在再灌注后45分钟时,这些心脏与对照I/R+PMN心脏无显著差异。

该模型中与I/R相关的心脏损伤与在45分钟的再灌注期内大量PMN浸润心肌密切相关。在再灌注期间,大量PMN迁移入心肌,从假手术I/R心脏中低于25个PMN/mm2增加至在再灌注期结束时I/R+PMN心脏中超过180个PMN/mm2(图4a)。相反地,在1、2.5和5μM上,I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂处理的心脏分别经历了20±6%、46±4%和48±3%的PMN浸润入再灌注后的心肌组织的显著减少(p<0.01);且该效应在L-NAME存在的情况下被阻断。此外,2.5和5μM处理的心脏,与1μM处理的心脏(p<0.01)(Fig.4a)相比,具有显著更少的浸润的PMN。

也在总的血管内的和浸润的PMN的评价中评估PMN对冠状脉管内皮的附着。如图4b中所见,在I/R+PMN+PKCξ肽抑制剂心脏(5μM)中附着至冠状动脉内皮的PMN的数目未显著减少(43±10%,p<0.06)(图4b)。测量大鼠主动脉内皮的NO释放,用于确定PKCξ肽抑制剂是否通过涉及增加内皮释放NO的机制提供心脏保护作用。在图5中,PKCξ肽抑制剂处理的内皮产生,与基线NO释放相比,显著更多的NO,增加了47±2%(2.5μM,p<0.05)、54±5%(5μM,p<0.01)和91±15%(15μM,p<0.01)。在1μM时,NO释放与基线NO释放无显著差异。乙酰胆碱(200nM)在NO测定中用作阳性对照,且与基线NO释放相比,NO释放显著地增加了67±4%(p<0.01)。为了将NO的基线释放减少至0,将eNOS抑制剂L-NAME用作另一种对照。通过用L-NAME(400μM)处理内皮组织完全抑制了乙酰胆碱和PKCξ肽抑制剂诱导的NO的产生。为了证实NO的来源归因于内皮组织,使用除去内皮的(裸露的)大鼠主动脉节段与PKCξ肽抑制剂(5μM)一起温育,该除去内皮的大鼠主动脉节段与L-NAME处理的节段无差异。

太阳城集团PKCξ肽抑制剂的心脏保护效应的另一个机制可能涉及过氧化物释放的抑制。除了在1μM(在该处与PMA刺激的大鼠PMN的悬浮液无差异),PKCξ肽抑制剂显著抑制过氧化物的释放达33-82%(2.5-15μM,p<0.01)(图6)。SOD(10μg/mL)在过氧化物测定中用作阳性对照,由PMA刺激的大鼠PMN产生的过氧化物释放下降99%(p<0.01;图6)。

实施例2-PKCβII的肽抑制剂的作用

基本上如实施例1中对于PKCξ肽抑制剂所描述的一样进行使用PKCβII肽抑制剂的实验。

使用下列分离的经灌注的大鼠心脏组:

组1:假手术I/R心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注,但在进入灌注的第35分钟(在相同的太阳城集团点给I/R心脏提供5mL血浆,15分钟的基线记录和20分钟的局部缺血)用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注。这些心脏代表对照组(n=6),用于确定所述分离的大鼠心脏在整个80分钟的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax。

太阳城集团组2:假手术I/R+PKCβII肽抑制剂(10μM)心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注。在进入灌注的第35分钟给这些心脏施用PKCβII肽抑制剂(10μM,将5mM在水中配制的母液溶解在血浆中)。该组(n=6)用于确定PKCβII肽抑制剂是否引起强心或心脏功能抑制作用。

组3:将I/R心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注,但不用PMN进行灌注。这些心脏代表了对照组(n=6),所述对照组用于确定在20分钟的局部缺血后进行再灌注是否使心脏昏迷,但在45分钟的再灌注期结束时LVDP和+dP/dtmax将恢复至基线值(初始值)。

太阳城集团组4:将I/R+PKCβII肽抑制剂(10μM,溶解在血浆中)心脏接受20分钟的局部缺血但不用PMN灌注。在再灌注的第一个5分钟期间用5mL的血浆+PKCβII肽抑制剂灌注这些心脏。该组(n=6)用于确定PKCβII肽抑制剂是否在无PMN的I/R背景中引起心脏功能抑制效应。

太阳城集团组5:将I/R+PMN心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)和PMN(重悬浮于5mL Krebs缓冲液中)进行灌注。这些心脏代表了对照组(n=9),所述对照组用于确定在20分钟的局部缺血后在PMN(200×106)存在的情况下进行45分钟的再灌注是否在整个45分钟的再灌注期导致,与初始基线值相比,持续的心肌收缩功能障碍。

太阳城集团组6:将I/R+PMNs+PKCβII肽抑制(1μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用1μM PKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定PKCβII肽抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

组7:将I/R+PMNs+PKCβII肽抑制剂(5μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5μM PKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定更高PKCβII抑剂浓度上的PKCβII肽抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=7)。

组8:将I/R+PMNs+PKCβII肽抑制剂(10μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用10μM PKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定更高PKCβII肽抑制剂浓度上的PKCβII抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=7)。

组9:将I/R+PMNs+PKCβII肽抑制剂(10μM)+NG-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME,50μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用10μM PKCβII肽抑制剂(溶解在5mL血浆中)和50μM L-NAME(将50mM的水中配制的母液溶解在Krebs缓冲液中)和PMN(200×106)进行灌注。在整个45分钟的再灌注期间将L-NAME(50μM)连续地灌注入心脏。这些心脏代表了用于确定PKCβII肽抑制的心脏保护效应是否可用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)阻断的组(n=6)。

太阳城集团前面的研究显示,给予PMN的假手术I/R心脏,与初始对照值相比,没有显示变化(Lefer等人,Circulation 100:178-184,1999)。在再灌注后45分钟中每5分钟记录数据。在进行每个实验之后,分离左心室,将其在4%的多聚甲醛中固定并在4℃下贮存以用于以后的组织学分析。

太阳城集团图7显示假手术I/R、I/R、I/R+PMN+PKCβII抑制剂(10μM)和I/R+PMN组的心肌收缩功能(LVDP)的时程和举例说明了在80分钟的灌注期期间LVDP的变化。假手术I/R组中的心脏在整个灌注期期间保持在初始基线值的103±4%。I/R组中的心脏在再灌注的初始阶段期间经历了LVDP的降低,但在再灌注结束时,其已恢复至初始基线值的94±6%。然而,I/R+PMN组中的心脏展示严重的心肌收缩功能障碍,在再灌注结束时只恢复至初始基线值的43±5%。相反地,I/R+PMN+PKCβII肽抑制剂(10μM)中的心脏,尽管最初在进入再灌注的第15分钟时显示LVDP降低为初始基线值的61±10%,但恢复至基线的82±9%。

太阳城集团为了确定PKCβII肽抑制剂是否对心肌收缩功能产生任何直接的收缩能效应,用PKCβII肽抑制剂(10μM)灌注假手术I/R心脏。该组用作用于所述研究的一个对照。这些心脏在80分钟的再灌注期结束时没有显示LVDP(图8)或+dP/dtmax(图9)的任何显著变化,因此,表明在该剂量上,PKCβII肽抑制剂对心肌收缩功能没有直接作用。对假手术I/R心脏进行20μM剂量的PKCβII肽抑制剂的检测,在该剂量上没有明显的心脏功能抑制作用。

图8和9分别显示来自分离的经灌注的心脏的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值。所有研究的组的初始基线值之间没有显著的差异。在假手术I/R、I/R、假手术I/R+PKCβII肽抑制剂(5μM)和I/R+PKCβII肽抑制剂(10μM)组的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值之间没有显著的差异。然而,I/R+PMN组的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值之间存在显著差异。观察到,在再灌注后45分钟,LVDP显著降低至初始基线的43±5%(p<0.01),+dP/dtmax显著降低至基线的42±6%(p<0.01)。

以5μM和10μM剂量存在的PKCβII肽抑制剂减弱了与使用PMN的局部缺血后灌注相关的LVDP和+dP/dtmax的降低。10μM的剂量是最具心脏保护作用的,因为在再灌注后第45分钟,I/R+PMN+PKCβII肽抑制剂(10μM)中的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别恢复至初始基线的82±9%和79±10%。这些值与再灌注后45分钟的I/R+PMN显著不同(p<0.01)。尽管与10μM剂量的程度不同,5μM的剂量也具有心脏保护作用,因为在再灌注后第45分钟,I/R+PMN+PKCβII肽抑制剂(5μM)中的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别恢复至初始基线的69±7%和63±7%。5μM剂量的LVDP值与再灌注后第45分钟的I/R+PMN显著不同(p<0.05)。1μM剂量的PKCβII肽抑制剂不具有心脏保护作用,因为I/R+PMN+PKCβII肽抑制剂(1μM)组中的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别只恢复至57±4%和53±6%。1μM剂量组的LVDP和+dP/dtmax的终值与I/R+PMN组的终值没有显著差异。

PKCβII肽抑制剂(10μM)的心脏保护效应被IR+PMN+PKCβII肽抑制剂(10μM)+L-NAME(50μM)组中存在的L-NAME(50μM)阻断,因为在45分钟的再灌注期结束时LVDP和+dP/dtmax值分别只有初始基线值的56±2%和53±5%,并且与IR+PMN组的终值无显著差异(图3和4)。

太阳城集团测量来自大鼠主动脉内皮的NO释放以确定PKCβII肽抑制剂是否通过涉及增加内皮NO释放的机制提供心脏保护作用。图10显示当在5μM(p<0.05)和10μM(p<0.01)上与基线NO释放相比时,用PKCβII肽抑制剂处理的内皮节段产生显著更多的NO。测得NO释放的基线值为1.85±0.18pmole NO/mg组织。存在用PKCβII肽抑制剂刺激内皮的明确的剂量响应效应,因为1μM、2.5μM、5μM和10μM分别产生高于基线0.75±0.19、1.91±0.44、2.54±0.29和3.49±0.62pmoleNO/mg组织的NO释放的增加。

太阳城集团乙酰胆碱(Ach,500nM)在该测定中用作阳性对照且刺激所述内皮产生高于基线基础值的3.75±0.58pmole NO/mg组织的增加。为了将NO的基础释放减少至0,将L-NAME用作另一种对照。通过用L-NAME(400μM)处理内皮完全抑制乙酰胆碱和PKCβII肽抑制剂诱导的NO的产生。

可提供PKCβII肽抑制剂的心脏保护效应(即,LVDP)的另一种机制可能是PMN过氧化物释放的抑制。PKCβII肽抑制剂显著地抑制来自fMLP刺激的大鼠PMNS的悬浮物的过氧化物的释放(即,吸光率),对于5μM、10μM和20μM的抑制剂,过氧化物的释放从0.13±0.01分别减少至0.05±0.009(p<0.01)、0.02±0.004(p<0.01)和0.02±.007(p<0.01)(图11)。在1μM剂量上没有显著的过氧化物的抑制。SOD(10μg/ml)用作阳性对照且其清除由fMLP刺激的大鼠PMN释放的过氧化物,从而将响应减少至0.0016±0.0006。

实施例3-PKCβII和PKCξ的肽抑制剂的协同效应

基本上如实施例1和2中所描述的那样进行使用PKCβII和PKCξ肽抑制剂的实验。

太阳城集团使用下列分离的经灌注的大鼠心脏组:

组1:假手术I/R心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注,但在进入灌注的第35分钟(在相同的太阳城集团点给I/R心脏提供5mL血浆,15分钟的基线记录和20分钟的局部缺血)用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注。这些心脏代表对照组(n=6),用于确定所述分离的大鼠心脏在整个80分钟的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax。

组2:假手术I/R+PKCβII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂(5μM)心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注。在进入灌注的第35分钟给这些心脏施用PKCβII和PKCξ肽抑制剂(分别为10μM和5μM,将在水中配制的5mM母液溶解在血浆中)。该组(n=6)用于确定肽抑制剂是否引起强心或心脏功能抑制作用。

组3:使I/R心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注,但不用PMN进行灌注。这些心脏代表了对照组(n=6),所述对照组用于确定在20分钟的局部缺血后进行再灌注是使心脏昏迷,但在45分钟的再灌注期结束时LVDP和+dP/dtmax将恢复至基线值(初始值)。

太阳城集团组4:将I/R+PKCβII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂(溶解在血浆中)心脏接受20分钟的局部缺血但不用PMN灌注。在再灌注的第一个5分钟期间用5mL的血浆+PKCβII+PKCξ肽抑制剂灌注这些心脏。该组(n=6)用于确定所述肽抑制剂是否在无PMN的I/R背景中引起心脏功能抑制效应。

组5:将I/R+PMN心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)和PMN(重悬浮于5mL Krebs缓冲液中)进行灌注。这些心脏代表了对照组(n=11),所述对照组用于确定在20分钟的局部缺血后在PMN(200×106)存在的情况下进行45分钟的再灌注在整个45分钟的再灌注期是否导致,与初始基线值相比,持续的心肌收缩功能障碍。

组6:将I/R+PMN+PKCβII(5μM)+PKCξ(2.5μM)肽抑制剂心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用1μMPKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定PKCβII抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=7)。

组7:将I/R+PMNs+PKCβII(10μM)+PKCξ(2.5μM)肽抑制剂心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5μMPKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定更高PKCβII肽抑剂浓度上的PKCβII抑制在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

太阳城集团组8:将I/R+PMNs+PKCβII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂心脏接20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用10μM PKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定更高PKCβII肽抑剂浓度上的PKCβII抑制在减弱PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=7)。

组9:将I/R+PMNs+PKCβII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂+NG-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME,50μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用10μM PKCβII和5μM PKCξ肽抑制剂(溶解在5mL血浆中)和50μM L-NAME(将在水中配制的50mM母液溶解在Krebs缓冲液中)和PMN(200×106)进行灌注。在整个45分钟的再灌注期间将L-NAME(50μM)连续地灌注入心脏。这些心脏代表了用于确定所述肽抑制剂的心脏保护效应是否可用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)阻断的组(n=5)。

根据图12的时程,PKCβII(10μM)和PKCξ(5μM)肽抑制剂的组合导致了与I/R心脏的恢复速率匹配的恢复速率。当单独使用PKCβII(10μM)或PKCξ(5μM)肽抑制剂(实施例1和2)时没有观察到该结果,在所述实施例中,所述肽抑制剂处理的心脏的恢复速率比I/R心脏的恢复速率慢。

太阳城集团图13和14显示分别来自分离的经灌注的心脏的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值。如所预期的和与实施例1和2相似,在45分钟再灌注后,I/R+PMN组的LVDP和dP/dtmax的初始值和终值发生了显著改变,与初始基线相比,LVDP下降了大约50%(p<0.01),+dP/dtmax下降了大约45%(p<0.01)。

PKCβII和PKCξ肽抑制剂的存在减弱了与使用PMN的局部缺血后灌注相关的LVDP和+dP/dtmax的降低。10μM PKCβII和5μM PKCξ肽抑制剂剂量是最具心脏保护作用的,将PKCβII肽抑制剂剂量从5μM增加至10μM不导致心脏保护效应的显著改变。在另一方面,将PKCξ肽抑制的剂量从2.5μM增加至5μM导致心脏保护效应的边际性地(marginal)增加。

太阳城集团PKCβII和PKCξ肽抑制剂组合的心脏保护效应被IR+PMN+PKCβII(10μM)+PKCξ(5μM)肽抑制剂+L-NAME(50μM)组中存在的L-NAME(50μM)阻断,因为在45分钟的再灌注期结束时LVDP和+dP/dtmax值分别只有初始基线值的50%和40%,与IR+PMN组的终值无显著差异(图13和14)。

该模型中与I/R相关的心脏损伤与在45分钟的再灌注期内大量PMN浸润心肌密切相关。在再灌注期间,大量PMN迁移入心肌,再灌注期结束时从假手术I/R心脏中低于25个PMN/mm2增加至I/R+PMN心脏中超过175个PMN/mm2(图15)。相反地,I/R+PMN+PKCβII+PKCξ肽抑制剂处理的心脏经历了PMN浸润入再灌注后的心肌组织的显著减少。该效应在L-NAME存在的情况下被阻断。此外,将PKCβII肽抑制剂的剂量从5μM加倍至10μM,同时将PKCξ肽抑制剂的剂量保持在2.5μM,未显著地减少PMN浸润。在另一方面,将PKCξ肽抑制剂的剂量从2.5μM加倍至5μM,同时将PKCβII肽抑制剂的剂量保持在10μM,边际性地减少了PMN浸润(图15)。

太阳城集团也在总的血管内的和浸润的PMN的评价中评价PMN对冠状动脉内皮的附着。如图16中所见,在I/R+PMN+PKCβII+PKCξ肽抑制剂心脏中附着至冠状动脉内皮的PMN的数目减少。该保护效应在L-NAME存在的情况下被逆转。

在图17中,用PKCβII和PKCξ肽抑制剂特别是以10μM PKCβII和5μM PKCξ肽抑制剂的剂量处理的心脏内皮产生,与基线NO释放相比,显著更多的NO。乙酰胆碱(500nM)在NO测定中用作阳性对照,其与基线NO释放相比,显著增加了NO释放。为了将NO的基线释放减少至0,将L-NAME用作另一种对照。通过用L-NAME(400μM)处理内皮组织完全抑制了乙酰胆碱和肽抑制剂诱导的NO的产生。

PKCβII和PKCξ肽抑制剂的心脏保护效应的另一个机制可能涉及过氧化物释放的抑制。如从图18中所见,当与PMA刺激的大鼠PMN的悬浮物相比或当与单独使用的PKCβII或PKCξ肽抑制剂相比时,PKCβII和PKCξ肽抑制的组合显著地抑制了过氧化物的释放。SOD(10μg/mL)在过氧化物测定中用作阳性对照,其将由PMA刺激的大鼠PMN产生的过氧化物释放减少了99%(图18)。

所述实施例都显示足够量的PKCβII肽抑制剂和/或PKCξ肽抑制剂的存在都通过减轻PMN诱导的心脏功能障碍来提供显著的心脏保护效应。

实施例4-PKCδ的肽激活物的效应

基本上如实施例1中对于PKCξ肽抑制剂所描述的那样进行使用PKCδ肽激活物的实验。

使用下列分离的经灌注的大鼠心脏组:

太阳城集团组1:假手术I/R心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注,但在进入灌注的第35分钟用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注(在相同的太阳城集团点给I/R心脏提供5mL血浆,15分钟的基线记录和20分钟的局部缺血)。这些心脏代表用于确定所述分离的大鼠心脏在整个80分钟的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax的对照组(n=6)。

太阳城集团组2:假手术VR+PKCδ肽激活物(10μM)心脏不接受局部缺血和不用PMN进行灌注。在进入灌注的第35分钟给这些心脏施用PKCδ肽激活物(10μM,将5mM的在水中配制的母液溶解在血浆中)。该组(n=6)用于确定PKCδ肽激活物是否引起强心或心脏功能抑制作用。

组3:将I/R心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)进行灌注,但不用PMN灌注。这些心脏代表了对照组(n=6),所述对照组用于确定在20分钟局部缺血后进行再灌注是使心脏昏迷,但在45分钟的再灌注期结束时LVDP和+dP/dtmax将恢复至基线值(初始值)。

太阳城集团组4:将I/R+PKCδ肽激活物(10μM,溶解在血浆中)心脏接受20分钟的局部缺血但不用PMN进行灌注。在再灌注的第一个5分钟期间用5mL的血浆+PKCδ肽激活物灌注这些心脏。该组(n=6)用于确定PKCδ肽激活物是否在无PMN的I/R背景中引起心脏功能抑制效应。

组5:将I/R+PMN心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5mL血浆(1mL/分钟)和PMN(重悬浮于5mL Krebs缓冲液中)进行灌注。这些心脏代表了对照组(n=10),所述对照组用于确定在20分钟的局部缺血后在PMN(200×106)存在的情况下进行45分钟的再灌注在整个45分钟的再灌注期是否导致,与初始基线值相比,持续的心肌收缩功能障碍。

组6:将I/R+PMNs+PKCδ肽激活物(1μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用1μM PKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定PKCδ肽激活在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

组7:将I/R+PMNs+PKCδ肽激活物(5μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用5μM PKCβII肽抑制剂(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定更高的PKCδ肽激活物浓度上的PKCδ激活在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

组8:将I/R+PMNs+PKCδ肽激活物(10μM)心脏接受20分钟的局部缺血并在再灌注的第一个5分钟期间用10μM PKCδ肽激活物(溶解在血浆中)和PMN(200×106)进行灌注。这些心脏代表了用于确定更高PKCδ肽激活物浓度上的PKCδ激活在减轻PMN诱发的心肌收缩功能障碍中的作用的组(n=6)。

前面的研究显示在给予PMN的假手术I/R心脏,与初始对照值相比,没有表现出变化(Lefer等人,Circulation 100:178-184,1999)。在再灌注后的45分钟中每5分钟记录数据。在进行每个实验之后,分离左心室,将其在4%的多聚甲醛中固定并在4℃下贮存以备用于以后的组织学分析。

太阳城集团图19显示了假手术I/R、I/R、I/R+PMN+PKCδ激活物(10μM)和I/R+PMN组的心肌收缩功能(LVDP)的时程和举例说明了在80分钟的灌注期期间LVDP的变化。假手术I/R组中的心脏的LVDP在整个灌注期期间保持在初始基线值的103±4%。I/R组中的心脏在再灌注的初始阶段期间经历了LVDP的降低,但在再灌注末期,其已恢复至初始基线值的82±3%。然而,I/R+PMN组中的心脏表现了严重的心肌收缩功能障碍,在再灌注结束时只恢复至初始基线值的46±9%。相反地,I/R+PMN+PKCδ激活物(10μM)中的心脏,尽管最初显示在进入再灌注的第15分钟LVDP降低为初始基线值的58±8%,但恢复至基线的83±3%。

太阳城集团为了确定PKCδ激活物是否对心肌收缩功能产生任何直接的收缩能效应,用PKCδ激活物(10μM)灌注假手术I/R心脏。该组用作所述研究的一个对照。这些心脏在80分钟的再灌注期结束时没有显示LVDP(图20)或+dP/dtmax(图21)的任何显著变化,因此,表明在该剂量上,PKCδ肽激活物对心肌收缩功能没有直接作用。

太阳城集团图20和21显示分别来自分离的经灌注的心脏的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值。所有研究的组的初始基线值之间没有显著的差异。在假手术I/R、I/R、假手术I/R+PKCδ肽激活物和I/R+PKCδ肽激活物(10μM)组的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值之间没有显著的差异。然而,I/R+PMN组的LVDP和+dP/dtmax的初始值和终值之间存在显著差异。观察到在45分钟的再灌注后,LVDP显著地降低至初始基线的46±9%(p<0.01),+dP/dtmax显著地降低至初始基线值的45±8%(p<0.01)。

以5μM和10μM剂量存在的PKCδ肽激活物减弱了与使用PMN的局部缺血后灌注相关的LVDP和+dP/dtmax的降低。10μM的剂量是最具心脏保护作用的,因为在再灌注后第45分钟,I/R+PMN+PKCδ肽激活物(10μM)中的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别恢复至初始基线的83±3%和79±5%。这些值在再灌注后第45分钟与I/R+PMN显著不同(p<0.01)。尽管与10μM剂量的程度不同,5μM的剂量也具有心脏保护作用,因为在再灌注后第45分钟,I/R+PMN+PKCδ肽激活物(5μM)中的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别恢复至初始基线的80±9%和67±7%。再灌注后第45分钟5μM剂量的LVDP值与I/R+PMN显著不同(p<0.05)。1μM剂量的PKCδ肽激活物不具有心脏保护作用,因为I/R+PMN+PKCδ肽激活物(1μM)组中的心脏的LVDP和+dP/dtmax分别只恢复至60±13%和51±5%。1μM剂量组的LVDP和+dP/dtmax的终值与I/R+PMN组的终值没有显著差异。

可提供PKCδ肽激活物的心脏保护效应(即LVDP)的机制可能是PMN的过氧化物释放的抑制。PKCδ肽激活物显著地抑制来自PMA刺激的大鼠PMNS的悬浮物的过氧化物的释放(即,吸光率),对于5μM和10μM的抑制剂,过氧化物的释放从0.49±0.03分别减少至0.32±0.03(p<0.01)、0.32±0.02(p<0.01)(图22)。在1μM剂量上没有显著的过氧化物的抑制。

太阳城集团尽管此处已明确地描述了本发明的某些目前优选的实施方案,但对于与本发明相关的领域内的技术人员来说,很明显的是可进行此处显示的和描述的各种实施方案的变化和改变而不背离本发明的精神和范围。因此,本发明只限定于由所附的权利要求和适用的法律的规则所要求的程度。

序列表

太阳城集团<110>Young,Lindon

<120>用于器官的灌注和/或保存溶液

<130>072689-00107

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

太阳城集团<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人类

太阳城集团<400>1

太阳城集团Ser Leu Asn Pro Glu Trp Asn Glu Thr

太阳城集团1               5

<210>2

<211>13

太阳城集团<212>PRT

太阳城集团<213>人类

<400>2

Ser Ile Tyr Arg Arg Gly Ala Arg Arg Trp Arg Lys Leu

1               5                   10

<210>3

<211>8

太阳城集团<212>PRT

太阳城集团<213>人类

太阳城集团<400>3

太阳城集团Met Arg Ala Ala Glu Asp Pro Met

太阳城集团1               5

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